Mikrosatelity (SSRs - simple sequence repeats)

Mikrosatelity se vyskytují jak v jaderné, tak v chloroplastové DNA.

Protokol lze rozdělit do dvou částí:

• PCR s dvojicí specifických primerů – pro amplifikaci konkrétního úseku DNA, který obsahuje repetitivní mikrosatelitovou sekvenci jsou použity dva primery, jeden z primerů je fluorescenčně značený (používáme barvy HEX, NED, 6-FAM).
  Pokud je třeba analyzovat více mikrosatelitových lokusů (často se analyzuje 8-10), je výhodné pokusit se sestavit tzv. multiplex PCR. Je to v podstatě běžná PCR reakce, do které přidáme více primerových páru najednou a amplifikujeme tak více lokusů (až třeba pět) v jedné PCR reakci. Můžeme tak výrazně snížit finanční i časové náklady na analýzu. Pro úspěšnou a dostatečnou amplifikaci všech lokusů musíme zaručit, aby (1) primery měly přibližně stejnou teplotu annealingu, (2) primery v jedné PCR reakci nevytvářely dimery, (3) lokusy s překrývajícím se rozsahem předpokládaných délek fragmentů byly označeny jinou fluorescenční barvou. Otestovat vytváření primerových dimerů a vhodnost kombinace primerových párů můžeme udělat např. v programu FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm, freeware).
• přesrážení produktu s NaOAc a přidání fluorescenčně značeného standardu – slouží k přečištění PCR produktů. Poté je k produktu přidán fluorescenčně značený žebříček (např. GeneScan-ROX-500). Ten se přidává jako vnitřní standard ke každému vzorku, aby bylo později možné identifikovat délku každého fragmentu (alely) a jednoznačně ji srovnávat s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu.
  fragmentační analýza na automatickém sekvenátoru – v kapilárním sekvenátoru ABI 3100 Avant (v sekvenační laboratoři PřF UK) jsou mikrosatelitové alely elektroforeticky rozděleny podle délky.

1. PCR amplifikace

Do 1.5 ml eppendorfky si napipetujeme směs pro příslušný počet vzorků podle návodu. Toto je obecný příklad, vždy je lepší se držet postupu popsaného v originální práci! V případě multiplex PCR se přidají forward a reverse primery pro příslušné kompatibilní lokusy, objem vody se dopočítá do 20 ml (včetně templátové DNA!).

Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a po 17 ml rozpipetujeme do PCR zkumavek (případně stripů). Přidáme 3 μl naředěné DNA (5 ng/μl), promícháme na vortexu a vložíme do termocykleru s následujícím programem (teplotu annealingu - T_a - nastavíme podle originálního protokolu):

Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost amplifikace na 1% agarosovém gelu v TAE bufferu. Na gelu by měl být vidět jeden proužek (nebo i více v případě multiplex PCR) odpovídající předpokládené velikosti alel (podle originální práce). Podle intenzity fragmentu naředíme PCR produkt 1:2 až třeba 1:20 (ředění je třeba vyzkoušet a podle intenzity peaků ze sekvenátoru případně upravit).

2. precipitace s acetátem sodným a přidání standardu

• na stěnu 1.5 ml eppendorfky napipetujeme 1 μl NaOAc (acetátu sodného)
• přidáme 1 μl naředěného PCR produktu (případně po 1 μl z více produktů značených odlišnou barvou)
• přidáme 25 μl 96% ethanolu
• promícháme na vortexu, krátce zcentrifugujeme
• necháme 20 minut při –20 °C
• centrifugujeme v předchlazené centrifuze 30 minut při 4 °C
• opatrně slijeme supernatant
• přidáme 100 μl 70% ethanolu
• centrifugujeme v předchlazené centrifuze 5 minut při 4 °C, supernatant slijeme
• otevřené zkumavky necháme 5 minut stát při laboratorní teplotě
• vysušíme 5-10 min při 65 °C (na termobloku)
• vzorky můžeme skladovat 1-2 týdny při 4 °C

Těsně před odnesením vzorků na sekvenátor pokračujeme následujícím způsobem:

• v 1.5 ml eppendorfce si připravíme směs pro příslušný počet vzorků

• směs promícháme na vortexu a krátce zcentrifugujeme

• přidáme 10 μl směsi ke vzorku
• promícháváme na termomixeru 3 minuty při 95 °C a 300 rpm
• vzorky v daném pořadí přepipetujeme na platíčko do sekvenátoru (optical plate)