Sekvenování DNA

• PCR amplifikace konkrétního úseku DNA pomocí dvojice specifických primerů.
• přečištění PCR produktu – nejčastěji pomocí komerčních kitů (např. QIAGEN nebo Genomed JETQUICK)
• cyklické sekvenování (cycle sequencing) – pomocí kitu BigDye 3.1
• precipitace produktů sekvenační reakce – s acetátem sodným a ethanolem
• sekvenační analýza na automatickém sekvenátoru – v kapilárním sekvenátoru ABI 3100 Avant (v sekvenační laboratoři PřF UK)

1. PCR amplifikace

• Do 1.5 ml eppendorfky si připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků. Množství polymerázy i studované DNA je možné měnit, v tom případě upravíme objem vody tak, aby celkové množství bylo 20 μl.

• jako primery použijeme forward a reverse primery podle toho, jaký úsek chceme sekvenovat

• rozpipetujeme do jednotlivých zkumavek příslušný objem směsi (v tomto případě 19 μl) a přidáme 1 μl DNA

• zkumavky vložíme do termocykleru s následujícím programem:

• teplotu annealingu a dobu elongace nastavíme podle amplifikovaného úseku. Téměř vždy je dobré provést gradientový test optimální teploty annealingu před sekvenováním většího množství vzorků.

• otestujeme amplifikovaný produkt nanesením cca 5 μl na agarosový gel (1%) v TAE bufferu. Na gelu by měl být vidět jeden proužek v délce zhruba odpovídající očekávané dle tabulky.

2. přečištění PCR produktu pomocí GENOMED Jetquick kitu

• k 15 μl PCR produktu přidáme 60 μl „H1 solution“ a důkladně promícháme na vortexu
• vložíme kolonku do označené (!) 2 ml eppendorfky bez víčka (z kitu), přepipetujeme do ní směs z předchozího bodu
• centrifugujeme 1 minutu při maximálních otáčkách
• vylijeme to, co proteklo kolonkou (DNA zůstala navázána na membráně)
• vložíme kolonku zpátky do 2 ml eppendorfky a přidáme 500 μl „H2 solution“
• centrifugujeme 1 minutu při maximálních otáčkách
• vylijeme to, co proteklo kolonkou (DNA navázaná na membráně se promyla)
• vložíme kolonku zpátky do 2 ml eppendorfky a centrifugujeme 1 minutu při maximálních otáčkách
• vložíme kolonku do nové (a označené!) 1.5 ml eppendorfky a přímo do středu membrány napipetujeme 30 μl 1× TE bufferu předehřátého na 60 °C
• necháme stát 5 minut
• centrifugujeme 2 minuty při maximálních otáčkách

• změříme koncentraci DNA pomocí fotometru

Pro podrobnější návod a další poznámky k přečištění PCR fragmentů viz návod ke kitu.
Také je možné použít QIAquick PCR Purification Kit (případně vyříznout PCR fragment z gelu a přečistit pomocí QIAquick Gel Extraction Kit)

3. cyklické sekvenování

• sekvenační reakci provádíme pomocí kitu BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit od firmy ABI

• napipetujeme sekvenační reakci dle tabulky (viz poznámky pod tabulkou):

• celkový objem sekvenační reakce je 20 μl, z toho 7 μl tvoří Ready Reaction Mix, Buffer a primer, vody a PCR produktu je zbylých 13 μl
• v případě ½ a ¼ reakce šetříme sekvenační premix a část jí nahrazujeme sekvenačním pufrem, použijeme v případě sekvenování bezproblémového templátu
• primer již je naředěn na 3.2 pmol/ml, tj. přidáváme 1 μl
• množství templátové DNA je podle následující tabulky (nejběžněji sekvenujeme fragmenty okolo 1000 bp a používáme 15 ng DNA), množství PCR produktu v μl tedy závisí na naměřené koncentraci:

• pro každý vzorek podle koncentrace PCR produktu spočítáme kolik μl je potřeba, aby v reakci bylo přítomno např. 15 ng DNA a podle toho upravíme množství vody pro příslušný vzorek
• připravíme směs z Ready Reaction Mix, Bufferu a primeru pro příslušný počet vzorků (pracujeme na ledu, obsahuje polymerázu), promícháme na vortexu, krátce stočíme
• rozpipetujeme směs do PCR zkumavek nebo do stripů a ke každému vzorku přidáme spočítané množství vody a PCR produktu
• promícháme na vortexu, lehce stočíme v minicentrifuze a vložíme do PCR cycleru s následujícím programem:

4. precipitace produktu

• produkt sekvenační reakce přepipetujeme do popsaných 0.5 ml eppendorfek
• ke 20 μl produktu přidáme 2 μl 3M NaOAc (acetát sodný) a 50 μl 96% ethanolu
• promícháme a necháme stát při laboratorní teplotě 10-15 minut
• centrifugujeme v chlazené centrifuze 30 minut při 13 200 rpm a 22 °C
• opatrně odpipetujeme supernatant (precipitát není vidět)
• přidáme 250 μl 70% ethanolu, promícháme a centrifugujeme v chlazené 15 minut při 13 200 rpm a 22 °C
• zopakujeme předchozí dva body
• otevřené zkumavky s odpipetovaným supernatantem necháme 5 minut stát při laboratorní teplotě
• vysušíme 5-10 minut při 65 °C (na termobloku), ubrouskem otřeme zbytky ethanolu ze svrchní části zkumavky
• ve vysušené formě je produkt připraven k odnesení do Laboratoře sekvenace DNA (Viničná 5, 2.suterén)
• produkt v této formě vydrží 1-2 týdny při 4 °C

Další informace též na stránce Laboratoře sekvenace DNA (Centrum servisních laboratoří biologické sekce PřF UK v Praze)