AFLP II. - precipitace produktů a příprava pro sekvenátor

• do čistých PCR zkumavek (stripů) přepipetujeme po 3 μl od každého selektivního PCR produktu (případně „vyladěný“ poměr jednotlivých produktů), uzavřeme, promícháme na vortexu, krátce zcentrifugujeme

• na stěnu 1.5 ml eppendorfky napipetujeme 1 μl NaOAc (acetátu sodného)
• přidáme 3 μl směsi tří selektivních PCR produktů
• přidáme 25 μl 96% ethanolu
• promícháme na vortexu, krátce zcentrifugujeme
• necháme 20 minut při –20 °C
• centrifugujeme v předchlazené centrifuze 30 minut při 4 °C
• opatrně slijeme supernatant
• přidáme 100 μl 70% ethanolu
• centrifugujeme v předchlazené centrifuze 5 minut při 4 °C, supernatant slijeme
• otevřené zkumavky necháme 5 minut stát při laboratorní teplotě
• vysušíme 5-10 min při 65 °C (na termobloku)
• vzorky můžeme skladovat 1-2 týdny při 4 °C

Těsně před odnesením vzorků na sekvenátor pokračujeme následujícím způsobem:

• v 1.5 ml eppendorfce si připravéme směs pro příslušný počet vzorků

• směs promícháme na vortexu a krátce zcentrifugujeme
• přidáme 10 μl směsi ke vzorku
• promícháváme na termomixeru 3 minuty při 95 °C a 300 rpm
• vzorky v daném pořadí přepipetujeme na platíčko do sekvenátoru (optical plate