RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - protokol
Metoda RAPD je jednou z metod založených na PCR. Využívá toho, že do amplifikace vstupuje pouze jeden arbitrární primer o délce deset nukleotidů. Princip metody je v tom, že se několikrát v celém úseku studované DNA stane, že primery nasednou na protiběžných řetězcích DNA v amplifikovatelné vzdálenosti od sebe (do cca 4 kb). V tuto chvíli je umožněna amplifikace části DNA mezi nimi.
PCR směs pro RAPD může vypadat třeba takto:
| sterilní Milli-Q voda |
17.5 μl |
|
| 10x buffer (Sigma) |
2.5 μl |
|
| dNTP (10 mM) |
0.5 μl |
|
| primer (25 pmol/μl) |
0.4 μl |
|
| RedTaq DNA Polymerase (Sigma) (1U/μl) |
0.5 μl |
|
| studovaná DNA (cca 50 ng/μl) |
1.0 μl |
Případně je možno pro větší reprodukovatelnost využít komerčně dodávané směsi (např. ReadyMix od f. Sigma), která již obsahuje všechny potřebné chemikálie včetně DNA polymerázy:
| sterilní Milli-Q voda |
10.2 μl |
|
| ReadyMix |
12.5 μl |
|
| primer (25 pmol/μl) |
0.5 μl |
|
| + studovaná DNA (cca 50 ng/μl) |
1.0 μl |
Nejprve si vyndáme všechny „ingredience“ z mrazáku (kromě polymerázy, tu vyndáváme až těsně před pipetování a pak okamžitě vracíme zpět, abychom nesnižovali její aktivitu), necháme rozmrznout a vložíme na led. Mezitím si popíšeme PCR zkumavky nebo stripy (nejlépe v horní části). Všechny následující práce provádíme na ledu nebo na mrazicím stojánku. Do 1.5 ml ependorfky napipetujeme PCR mix (kromě DNA ovšem!) pro počet vzorků+1, nejprve vodu, polymerázu naposledy, promícháme na vortexu a krátce stočíme v centrifuze. Jako primer vybereme jeden z těch, které jsou k dispozici. Rozpipetujeme do jednotlivých zkumavek příslušný objem směsi (v tomto případě 23.2 ml) a přidáme 1 ml DNA.
Zkumavky vložíme do termocykleru s následujícím programem:
| 94 °C |
3:00 |
|
| 94 °C |
1:00 |
¦ |
| 36 °C |
1:00 |
¦ 45× |
| 72 °C |
2:00 |
¦ |
| 72 °C |
10:00 |
|
| 10 °C |
hold |
Produkty této reakce můžeme elektroforeticky rozdělit podle délky na 1.8 % agarozovem gelu v TBE bufferu a visualizovat pomocí ethidiumbromidu. Pro vyšší rozlišení je možno použít polyakrylamidový gel obarvený SYBR Green I.
Akce dokumentů