PCR-RFLP
Tato metoda se skládá ze dvou kroků:
- amplifikace konkrétního úseku DNA (například intergenických oblastí v chloroplastové DNA) pomocí dvojice známých primerů. Často se využívá primerů, které jsou komplementární k začátkům a koncům kódujících genů okolo nekódující intergenické oblasti. Tyto primery pak bývají využitelné u většiny rostlinných druhů. Sekvence, teplotu annealingu, potřebnou dobu elongace pro cpDNA primery, které jsou k dispozici v laboratoři, najdeme v sekci Chloroplastové primery.
- restrikce (naštípání) namnoženého úseku pomocí enzymů zvaných restrikční endonukleázy, které specificky štěpí DNA. Například enzym zvaný EcoRI rozštěpí DNA vždy, pokud nalezne sekvenci 3´-GAATTC-5´. Pokud je takovéto místo v našem studovaném úseku DNA právě jednou, uvidíme pak po elektroforéze místo jednoho proužku dva. Pokud ale bylo místo změněno, např. mutací, k rozštěpení nedojde a proužek bude stále jeden. Pomocí této metody tedy hledáme polymorfismus v restrikčních místech nejrůznějších endonukleáz a následně ho interpretujeme jako příbuznost či nepříbuznost organismů. Jakou sekvenci štěpí příslušná restrikční endonukleáza (od f. Fermentas) a jejich další vlastnosti najdeme na plakátě na ledničce (a nebo zde). Veškeré informace o restrikčních endonukleázách lze nalézt na webu Fermentas nebo zde (5.6 MB)
1. protokol na amplifikaci
příklad PCR mix pro PCR-RFLP cpDNA
| sterilní Milli-Q voda | 17.30 ml |
| 10× PCR buffer (Sigma) |
2.00 ml |
| dNTP (10 mM) |
0.40 ml |
| primer 1 (25 pmol/ml) |
0.25 ml |
| primer 2 (25 pmol/ml) |
0.25 ml |
| (Jump Start) Red Taq DNA Polymerase (Sigma) (1U/ml) |
0.50 ml |
| + studovaná DNA (5 ng/ml) |
1.00 ml |
Se všemi chemikáliemi pracujeme na ledu. Polymerázu vyndáme z mrazáku až těsně před pipetováním a pak ji ihned vracíme zpátky. Jako primery použijeme jednu dvojici z těch, které jsou k dispozici (viz tabulka). Rozpipetujeme do jednotlivých zkumavek příslušný objem směsi (v tomto případě 20.7 ml) a přidáme 1 ml DNA.
Zkumavky vložíme do termocykleru s následujícím programem:
|
94 °C |
1:00 |
|
|
94 °C |
0:45 |
¦ |
|
52-62 °C |
0:45 |
¦ 35× |
|
72 °C |
2:00-4:00 |
¦ |
|
72 °C |
10:00 |
|
|
10 °C |
hold |
Teplotu annealingu a dobu elongace nastavíme podle použitého primeru (viz sekce Chloroplastové primery).
Po proběhnuté reakci otestujeme amplifikovaný produkt nanesením cca 5 ml na agarosový gel (1%) v TAE bufferu. Do první jamky na gelu naneseme 3 ml žebříčku (100 bp Gene Ruler). Na gelu by měl být vidět jeden proužek v délce zhruba odpovídající očekávané dle tabulky. Jeho délku odhadneme pomocí softwaru KODAK 1D Image Analysis Software porovnáním s proužky žebříčku.
Pokud je na gelu viditelný jeden jasný proužek v délce zhruba odpovídající délce fragmentu dle tabulky, povedlo se nám namnožit studovaný úsek a můžeme přistoupit k jeho štěpení.
2. protokol na restrikci
Restrikce musí probíhat za stálého optimálního pH a teploty. Stálé pH je zaručeno přidáním restrikčního pufru do reakční směsi, stálou teplotu zajistí inkubátor nebo příslušně nastavený termocykler. Maximální aktivita restrikčních endonukleáz od f. Fermentas je zajišťována jedním z pětice pufrů dodávaných s příslušným enzymem (viz barevně označené enzymy na plakátě na ledničce). Zvolíme tedy jeden z dostupných enzymů a k němu vybereme příslušný pufr.
Příklad směsi pro restrikci fragmentu:
| sterilní Milli-Q voda |
11.1 ml |
| restrikční pufr |
2.0 ml |
| restrikční enzym |
0.3 ml |
Opět si do 1.5 ml ependorfky napipetujeme směs jednotlivých složek pro příslušný počet vzorků+1 (v tomto pořadí). Stále pracujeme na ledu. Enzym opět uchováváme v mrazáku až do doby těsně před jeho pipetováním. Rozpipetujeme do jednotlivých PCR zkumavek příslušný objem směsi (v tomto případě 13.4 ml) a přidáme 3 ml amplifikované DNA. Zkumavky vložíme na 4h nebo přes noc do termocykleru nastaveného tak, aby držel teplotu 37 °C. Po inkubaci smícháme obsah každé zkumavky se 3 ml 6x loading dye a můžeme nanášet na gel (buď horizontální agarosový nebo pro větší rozlišení na vertikální polyakrylamidový).
Akce dokumentů