AFLP IV. - vyhodnocování dat v programu Genographer

Program je freeware (http://hordeum.oscs.montana.edu/genographer) a k jeho běhu je potřeba mít nainstalováno JRE (Java Runtime Environment, http://java.sun.com/j2se/1.4.2/download.html; stahujte J2SE JRE, nikoliv SDK!).

Program Genorapher rozbalíme do složky C:\genographer. Na ploše vytvoříme nového zástupce, který bude odkazovat na soubor javaw.exe. Ten příkazem -cp spustí Genographer. „Cíl“ zástupce tedy bude např. "C:\Program Files\Java\j2re1.4.2_05\bin\javaw.exe -mx64m -cp C:\genographer genographer", Volba „Spustit v“ bude "C:\genographer". Nyní by se spuštěním zástupce měl spustit Genographer. (Příkazem –mx64m vyhradíme programu 64 MB paměti pro práci, hodnotu je možné změnit, u mnoha vzorků při větším zvětšení je to dokonce nutné.)

• Data (soubory *.fsa) naimportujeme do programu volbou File → Import
• příslušné soubory vybereme dvojklikem, případně můžeme importovat celý obsah adresáře volbou „Add All“
• „Files of Type“ vybereme jako ABI 3100/3700
• v dalším okně zvolíme barvu, kterou chceme importovat a nastavíme Size Standard na „GS-TAMRA-36A-2400“
• soubory se naimportují a dále s nimi můžeme pracovat podle následujících voleb:

• jednotlivé lokusy, které považujeme za spolehlivé (můžeme tedy jednoznačně určit, zda fragment je či není přítomen), skorujeme nezávisle na jejich intenzitě
• lokus vybereme myší přímo v gelu, můžeme upravovat šířku a polohu fragmentu
• o správném skorování se můžeme přesvědčit vybráním fragmentu vlevo od gelu (šedé záhlaví zčervená) a kliknutím na „Thumbnail“
• zobrazí se peaky pro jednotlivé vzorky, posunováním černého trojúhelníčku můžeme definovat hranici pro skorování (A jako přítomnost, B nepřítomnost)

  →

• takto definujeme veškeré lokusy, je výhodné si celý rozsah zobrazovat např. po 30 bp a ve větším rozlišení (např. 200%)
• skorujeme zpravidla fragmenty v rozsahu 100-500 bp, fragmenty kratší mají mnohem větší pravděpodobnost být nemohologní, fragmenty delší již nemají správně přiřazenou délku
• poté si můžeme výsledek analýzy zobrazit kliknutím na „Analysis“, kdy se ukáže výsledek skorování jednotlivých lokusů.

 →

• data je možné zkopírovat např. do Wordu, kde jednoduše nahradíme „A“ za „1“ a „B“ za „0“
• v Excelu potom datovou matici transponujeme, abychom měli v řádcích druhy a ve sloupcích jednotlivé lokusy
• soubor ve formáru Genographer (včetně definovaných lokusů) je možné si uložit příkazem File → Save As…  (pokud zadáme pouze „Save“ program přepíše předchozí uložený soubor, protože neobsahuje dodatečný dotaz na přepsání!)