AFLP I. - reakce
S využitím AFLP Core Reagent Kit & AFLP Pre-Amp Primer Mix I od firmy Invitrogen.
1. restrikce
- restrikční směs (pro 1 vzorek):
| buffer | 1.0 μl | |
| EcoRI/MseI | 0.4 μl | |
| H2O | 1.1 μl |
- přidat 2.5 μl studované DNA (koncentrace cca 50-200 ng/μl)
- inkubovat při 37 ºC (nejlépe v PCR cycleru, jinak převrstvit miner. olejem) po 2-3 hodiny
2. ligace
- ligační směs (pro 1 vzorek):
| adaptor ligation solution | 4.8 μl | |
| T4 ligase |
0.2 μl |
- přidat 5 μl směsi ke vzorkům po restrikci
- inkubovat při 37 ºC (nejlépe přes noc)
- test restrikce/ligace provedeme elektroforézou 3-5 μl produktu na 1.8% agarosovém gelu v 1×TBE bufferu při 60V
- na gelu by měl být vidět rozmazaný pruh rozštěpené DNA, především mezi 50-1000 bp.
3. preamplifikace
- preamplifikační směs (pro 1 vzorek):
| PA mix |
4.0 μl |
|
| 10x PCR buffer |
0.5 μl |
|
| DNA Polymerase (1U/1μl) |
0.1 μl |
- ke směsi přidat 0.5 μl DNA pro restrikci/ligaci
- PCR preamplifikace v termocykleru (program viz níže)
- po PCR přidat 45 μl ddH2O
- test preamplifikace můžeme provést nanesením 3 μl neředěného (!) produktu (smíchaného se 2-3 μl nanášecí barvičky) na 1.8% agarozový gel v 1× TBE bufferu při 60V
- na gelu má být vidět rozmazaný pruh fragmentů, některé z nich by měly být výraznější.
4. selektivní amplifikace
- dělá se vždy 3x pro každý vzorek, vždy s jinou kombinací selektivních primerů (modrá, zelená, žlutá - viz tabulka AFLP primerů)
- směs na selektivní amplifikaci (pro 1 vzorek):
| dd H2O | 5.1 μl | |
| 10x PCR buffer |
1.0 μl |
|
| dNTP |
0.2 μl |
|
| EcoRI primer (značený) |
0.5 μl |
|
| MseI primer |
0.5 μl |
|
| DNA Polymerase (1U/1μl) |
0.2 μl |
- přidat 2.3 μl preselektivní DNA
- PCR selektivní amplifikace v termocykleru (program viz níže)
PCR programy
preselektivní PCR
ramping time=cca 2 °C/sec:
72 °C 02:00
----------------------------
94 °C 00:30 ¦
56 °C 00:30 ¦ 20x
72 °C 02:00 ¦
----------------------------
60 °C 30:00
4 °C hold
selektivní PCR
ramping time=cca 2 °C/sec
94 °C 02:00
65 °C 00:30
72 °C 02:00
----------------------------
94 °C 00:30 ¦
64 °C 00:30 (snížení teploty ¦ 8x
1°C/cycle) ¦
72 °C 02:00 ¦
----------------------------
94 °C 00:30 ¦
56 °C 00:30 ¦ 23x
72 °C 02:00 ¦
----------------------------
60 °C 30:00
4 °C hold
Akce dokumentů