Extrakce DNA ze sušeného rostlinného materiálu (CTAB metoda)

Příprava vzorků před extrakcí

• cca 0.5 mg suchého materiálu (ze silikagelu) vložíme do 2 ml eppendorfek (s kulatým dnem) a přidáme 2 wolfram-karbidové kuličky
• vždy 5+5 zkumavek vložíme do plastových držáků mlýnku Retsch Mixer Mill 200 (nebo MM 400), upevníme a utáhneme pojistku, přiklopíme plastový kryt, nastavíme požadovaný čas (např. 2 min) a frekvenci 30 ot./s a zmáčkneme „start“
• po nastaveném čase se mlýnek sám zastaví, zkontrolujeme zkumavky; drcení je hotovo, pokud jsou veškerá listová pletiva rozmělněna na prach, v opačném případě drtíme dalších několik minut, případně přidáme kuličky

Vlastní extrakce DNA - CTAB metoda

• k rozdrcenému materiálu přidáme 700 ml roztoku CTAB (případně s 2% merkaptoethanolem), pracujeme v digestoři
• přidáme 5 ml RNasy A
• zkumavky uzavřeme, krátce promícháme na vortexu a inkubujeme 30 min. na termomixeru při 60 °C a 1,400 rpm
• během prvních minut inkubace přidáme ke každému vzorku PVP
• centrifugujeme (se zavřeným víčkem centrifugy!) 6 min. při 13,200 rpm
• supernatant přepipetujeme do nových eppendorfek
• původní zkumavky ponecháme uzavřené ve stojánku v digestoři (po skončení práce je třeba vyjmout kuličky, očistit a nechat vyklávovat)
• v digestoři přidáme 500 ml směsi chloroform:isoamylalkohol (24:1)
• dobře uzavřené zkumavky 2-3´ převrátíme a necháme cca 5 min stát
• centrifugujeme 6 min. při 13,200 rpm
• supernatant (cca 500 ml) opatrně přepipetujeme do nových popsaných eppendorfek (1.5 ml), je třeba dát pozor, abychom pipetovali jen průhledný supernatant (!), pracujeme stále v digestoři a kontaminované špičky a 2ml eppendorfky vyhazujeme do zvláštní nádoby
• přidáme 500 ml vychlazeného isopropanolu (z mrazáku)
• 1-2 x převrátíme a necháme cca 30 min. stát v -20 °C
• centrifugujeme 3 min. při 13,200 rpm
• supernatant opatrně slijeme do kádinky (v digestoři), na dně eppendorfky lze vidět drobný matně bílý pellet DNA, otevřené eppendorfky převrátíme dnem nahoru na filtrační papír (ubrousek)
• přidáme 400 ml vychlazeného 96% ethanolu (z mrazáku)
• inkubujeme 15 min. na termobloku při 37 °C a 1,200 rpm
• centrifugujeme 3 min. při 13,200 rpm
• supernatant opět opatrně slijeme do kádinky (už nemusíme v digestoři)
• přidáme 200 ml vychlazeného 70% ethanolu (z mrazáku) a necháme cca 5 min. stát
• centrifugujeme 3 min. při 13,200 rpm
• supernatant opět opatrně slijeme do kádinky a eppendorfky necháme cca 10-15 min stát a vyschnout
• cca 1-2 min vysušíme pellet v otevřených eppendorfkách na termobloku při 90 °C, sušení ukončíme ve chvíli, kdy lze pellet poklepem (cvrnknutím) na uzavřenou (!) eppendorfku oddělit od stěny
• vysušený pellet rozpustíme ve 100ml TE pufru
• uzavřené eppendorfky inkubujeme 30 min. na termobloku při 37 °C a 600 rpm
• krátce promícháme na vortexu a krátce zcentrifugujeme
• DNA uchováváme v ledničce nebo dlouhodobě při -20 (-80) °C
• kvalitu DNA otestujeme nanesením 5μl na 0.8% TAE agarosový gel