Horizontální agarosová elektroforéza
- pracujeme v rukavicích, protože všechny věci mohou být kontaminovány ethidiumbromidem (známý karcinogen)
- do erlenky na předvážkách navážíme příslušné množství agarosy I (podle velikosti gelu, viz tabulka)
|
|
|
g agarosy |
|
|
|
%gel/vana |
malá |
malá dlouhá |
střední |
velká |
|
0,8 |
0,24 |
0,4 |
0,8 |
1,6 |
|
1 |
0,3 |
0,5 |
1 |
2 |
|
1,8 |
0,54 |
0,9 |
1,8 |
3,6 |
|
ml pufru |
30 |
50 |
100 |
200 |
|
napětí (V) |
100 |
100 |
120 |
150 |
|
Et. bromid |
1kapka |
1kapka |
2 kapky |
4kapky |
- přidáme příslušné množství 1×TAE nebo 1×TBE pufru (odměříme označeným odměrným válcem), lehce kroužením promícháme
- vložíme na 1-2 min. do mikrovlnky, v uvařeném gelu nesmí být krystalky
- mezitím si připravíme příslušně velkou komůrku na nalití gelu, vložíme ji do nalévacího zařízení (komůrka s gumovým těsněním) nebo ukončíme kovovými plíšky (komůrka s bočními držátky), nebo olepíme páskou
- do zářezů umístíme hřebínky s příslušným počtem zubů (tloušťka: bílé 1 mm, červené 1.5 mm)
- uvařený gel ochladíme kroužením erlenkou pod tekoucí vodou (držíme gumovou chňapkou, abychom se nespálili)
- přidáme ethidiumbromid z kapátka obaleného alobalem, počet kapek je uveden v tabulce
- gel pomalu naléváme do komůrky s instalovanými hřebínky, tuhne cca 30 minut
- po ztuhnutí gelu, opatrně vyjmeme hřebínky a plíšky, případně odstraníme pásku,komůrku vložíme do elektroforetické vany a zalijeme příslušným pufrem (1×TAE nebo 1×TBE) tak, aby celý gel byl těsně pod hladinou a všechny jamky byly zality
- do první jamky pipetujeme cca 1,5ul markeru (žebříčku), do dalších jamek pak 2-3ul DNA po PCR
- po napipetování všech vzorků přiklopíme víko s přívodními kabely (musí být na pravé straně elektroforetické vany!) a zapneme proud na zdroji
- napětí (V) nastavíme otáčením knoflíku (hodnoty jsou uvedeny v tabulce)
- ve chvíli, kdy čelo (nejrychlejší barvička) dojíždí ke konci gelu, vypneme proud, sejmeme víko vany, vyndáme komůrku a gel umístíme doprostřed plochy UV transiluminátoru dokumentačního systému Kodak Gel Logic 100
Akce dokumentů