Vertikální polyakrylamidová elektroforéza

Sestavení aparatury

• v aparatuře, která je k dispozici (V20-CDC), je možno používat najednou dva gely
• skla opláchneme vodou a omyjeme destilovanou vodou a necháme uschnout (např. přes noc)
• na podložku položíme větší sklo, na jeho boční okraje spacery a poté menší sklo s výřezem, opakujeme i pro druhou dvojici skel a spacerů
• nalévací stojánek postavíme spodní stranou na vodorovnou podložku
• na něj postavíme upínací modul, do kterého vložíme skla se spacery (vyřízlým sklem směrem dovnitř), srovnáme skla a spacery a lehce utáhneme šrouby, aby se skla nepohybovala a celý sendvič ještě jednou zkontrolujeme, především dbáme na to, aby spacery byly zarovnány se skly až dolů a skla umístěna opravdu svisle
• dotáhneme šrouby (přitom dáváme pozor, aby se skla nepohnula)
• spodní část skel lehce potřeme vazelínou
• zvedneme celý upínací modul, nalévací stojánek obrátíme, položíme do něj silikonové proužky a postavíme na ně upínací modul se skly
• utáhneme otočením šroubů, neutahujeme příliš velkou silou (!)

Příprava a nalití gelu

• v označené kádince smícháme následující chemikálie (odměřujeme pouze v příslušně označených odměrných válcích !)

• promícháme opatrným kroužením a v digestoři potom přidáme

• několik minut promícháváme obsah kádinky kroužením, gel je připraven k nalití

• nabereme roztok do velké stříkačky a opatrně vypouštíme po stěně skleněné desky mezi obě skla
• do výřezu vnitřního skla vložíme hřebínek a gel necháme 2-3 hodiny polymerovat

Nanášení vzorků a spuštění elektroforézy

• otočíme šrouby v nalévacím stojánku, uvolníme upínací modul se skly a vložíme ho do elektroforetické nádoby
• opatrně vyjmeme hřebínky (pozor na poškození komůrek) a stříkačkou okamžitě propláchneme komůrky 1x TBE bufferem
• nalijeme 1x TBE buffer do vnější (cca 3 500 ml) a do vnitřní (cca 650 ml) komory
• žlutou špičkou opatrně nanášíme 10-15 μl vzorku smíchaného s 6x loading dye
• na kraje a doprostřed gelu nanášíme 5 μl žebříčku (Gene Ruler 1 kb DNA Ladder)
• po nanesení všech vzorků přikryjeme elektroforetickou nádobu víkem a připojíme ke zdroji, napětí nastavíme na 200 V
• během elektroforézy sledujeme pohyb nejrychlejší barvičky v gelu a ve chvíli, kdy se blíží ke konci gelu, vypneme proud a odpojíme od zdroje

Ethidiumbromide staining

• upínací modul se skly vyjmeme napůl z elektroforetické nádoby, opatrně částečně uvolníme šrouby a necháme vytéct buffer z vnitřní komory
• uvolníme šrouby úplně a vyjmeme sendviče z upínacího modulu
• sendviče rozebereme pomocí plastové špachtle, gel nám zůstane na jednom ze skel
• skalpelem uřízneme cca 1 cm v levém dolním rohu gelu (abychom i později věděli, jaká byla původní orientace gelu)
• nad miskou opatrně uvolníme gel ze skla pomocí střičky s destilovanou vodou a přemístíme do barvicí misky
• z misky vylijeme přebytečnou vodou a nalijeme roztok ethidiumbromidu (ze zásobní láhve pokryté alobalem) tak, aby v něm byl gel ponořen
• kýváme a otáčíme miskou asi 5 minut (ethidiumbromid se váže na DNA), poté slijeme roztok zpět do zásobní láhve
• opatrně (opět pomocí střičky s vodou) přemístíme gel na navlhčenou plochu UV transilluminátoru, vyrovnáme do plochy, srovnáme podle okrajů a papírovým ubrouskem odsajeme přebytečnou vodu
• obraz gelu sejmeme pomocí dokumentačního systému Kodak Gel Logic 100