PCR-RFLP I. - princip metody
1. pomocí dvojice primerů PCR amplifikace konkrétního úseku DNA
- využití konsenzuálních primerů pro amplifikaci nekodujících úseků DNA (často rDNA, cpDNA)
- k dispozici celá řada primerů pro cpDNA
- výsledkem je namnožený produkt o délce 1000-4000 bp
2. restrikce PCR produktů restrikčními endonuklázami
- hledání délkové variability nebo bodových mutací v amplifikovaném úseku
- restrikční endonukleázy specificky štěpí dsDNA (double stranded - dvoušroubovicovou DNA)
- rozpoznávají konkrétní sekvenci - nejčastěji 4 nebo 6 bp
|
asymetrické štěpení (lepivé konce - sticky ends) např. EcoRI |
|
|
symetrické štěpení (tupé konce - blunt ends) např. AluI |
3. elektroforéza naštípaných fragmentů + visualizace fragmentů (např. pomocí ethidium bromidu)
Příklad PCR-RFLP gelu (polyakrylamidová elektroforéza, barveno SYBR Green)
Akce dokumentů