Ne všechny (nekanonické) aminokyseliny jsou si rovny
Členové Laboratoře struktury a funkce biomolekul již dříve úspěšně připravili proteiny, v nichž ve vysoké míře nahradili methionin jedním jeho syntetickým analogem. Domnívali se proto, že podobně dokáží nahradit methionin i dalšími analogy, na základě známých kinetických parametrů pro klíčový enzym – methionyl-tRNA synthetasu – předpoví četnost, s jakou bude k nahrazení docházet, a dosáhnou vyšší míry substituce při expresi proteinů v bakteriích se zablokovanou dráhou syntézy methioninu. O tom, jak se ve všech těchto předpokladech mýlili, ale i o tom, jak naopak ve shodě s Murphyho zákony zjistili, že nahrazení je tím snazší, čím menší má modifikovaná varianta proteinu praktické využití, se můžete dočíst v jejich novém článku v časopise International Journal of Molecular Sciences.
Globální nahrazení přirozených aminokyselin proteinu jejich analogy s bioortogonálnímí (neinterferujícími s biologickými procesy) funkčními skupinami má řadu využití v základním i aplikovaném výzkumu. Cílem této práce bylo zjištění, zda je možné dříve optimalizovaný postup nahrazení methioninu analogem obsahujícím diazirinovou funkční skupinu (foto-methioninem, pMet) využít také k zavedení analogů s azidoskupinou (azihodohomoalaninu, Aha) a trojnou vazbou (homopropargylglycinu, Hpg). Zatímco je pMet obvykle využíván jako síťovací činidlo aktivované UV zářením a zbylé dva analogy ke snadnému spojování s dalšími molekulami pomocí tzv. „click chemistry“, autoři je všechny tři hodlají využít méně obvyklým způsobem – ke studiu přenosu elektronu mezi cytochromy b5 a P450. K tomu účelu je nezbytné získat proteiny s vysokým obsahem aminokyselinových analogů na specifických pozicích.
V této práci proto autoři sledovali růstové charakteristiky kmenů E. coli BL-21 a B834 používaných k rekombinantní expresi, a pomocí hmotnostní spektrometrie analyzovali, jak se s časem měnila četnost, s jakou nekanonické aminokyseliny nahrazovaly svůj přirozený protějšek, a to celkem ve třech různých proteinech. Konstrukt obsahující zelený fluorescenční protein (tzv. GFP), který byl v této práci exprimován pro svou přirozenou fluorescenci, která umožnila jeho kvantifikace v průběhu kultivace, a pro větší počet methioninů v sekvenci, který posloužil pro porovnání míry substituce na jeho jednotlivých pozicích. Tento protein s nepřirozenými aminokyselinami, který nemá nad rámec této studie dalšího využití, byl získán s výrazně vyšším výtěžkem a mírně vyšší mírou nahrazení methioninu analogy, než tomu bylo v případě cytochromu b5, který měl naopak být využit také pro navazující experimenty. Poznatky studie lze tedy využít jako vodítko pro odhad maximální míry substituce methioninu jednotlivými analogy, kterého lze popsaným přístupem dosáhnout, pokud je cílový protein exprimován za optimálních podmínek, a také ukazuje, kterým směrem by se mohla optimalizace ubírat. Na neoptimální podmínky může například upozornit třetí ze sledovaných proteinů – pspA – který je exprimován bakteriemi jako reakce na nepříznivé podmínky.
Publikováno:
Pondělí 18.09.2023 10:00
Akce dokumentů