První fluorescenční barvivo pro sledování amyloidních fibril v živých buňkách

Lidské buňky obarvené barvivem RB1 (červená) a barvivem proteinů tvořících amyloidní fibrily (modrá). Proteiny patologických fibril jsou vidět ve fialové barvě a cytoplazmatické membrány v zelené.
zdroj: doplňující informace originálního článku

Amyloidní fibrily vznikají chybným seskládáním specifických proteinů uvnitř buněk. Ačkoliv jejich tvorba prokazatelně souvisí s postupem neurodegenerativních onemocnění, jejich role v projevu nemocí zůstává nejasná. Dosud je možné tyto útvary v buňkách pozorovat mnoha různými zobrazovacími technikami (transmisní elektronová mikroskopie, značení protilátek atd.), z nichž většinu nelze použít pro pozorování v živých buňkách. Vědci se pokusili tento problém vyřešit za využití fluorescenčních proteinů napojených na potřebné proteiny a jejich sledování pomocí fluorescenční spektroskopie. Tak velké útvary mohou změnit vlastnosti agregovaných proteinů ve fibrilách a tím ovlivnit celou jejich tvorbu. Pro zamezení vlivu velikosti částic byly zaznamenány snahy o využití nanočástic či nízkomolekulárních barviv, nicméně žádná z těchto metod zatím nebyla úspěšná v živých buňkách.

Úspěšné nízkomolekulární barvivo musí splňovat několik požadavků – dostatečná selektivita pro amyloidní fibrily, velký rozdíl mezi fluorescencí volného barviva a molekuly vázané na proteiny a v neposlední řadě musí mít molekula možnost snadného vstupu do buňky přes cytoplazmatickou membránu. A tak se zrodila barviva RB1 a RB2. První zmíněné barvivo vykazuje silnější fluorescenci v přítomnosti amyloidních fibril, což lze uspokojivě vysvětlit vyšší afinitou k amyloidům. To je dáno jeho tvarem vzhledem k hydrofobním kapsám fibril, do kterých barvivo dokonale zapadne. Díky skutečně výjimečné afinitě lze předpokládat, že barvivo RB1 se bude vázat selektivně na amyloidní fibrily i ve vysoce komplexním prostředí, jakým je živá buňka. Tuto hypotézu se vědci rozhodli otestovat na dvou liniích lidských buněk, přičemž v obou nastal očekávaný účinek. Barvivo dokázalo rozpoznat nejen již vytvořené amyloidní fibrily ale i monomerní proteiny. Takto lze tedy pozorovat i tvorbu patogenních útvarů s vysokým rozlišením přímo v živých buňkách.

Kromě požadovaného obarvení cytosolárních fibril dokázalo nové barvivo obarvit i buněčné jadérko. Ačkoliv by se mohlo zdát, že to bude překážkou v selektivitě barviva, není tomu tak. Jadérko je dostatečně morfologicky odlišné a navíc výskyt amyloidních fibril v něm je nemožný, tudíž vědcům v pozorování vůbec nepřekáží a naopak ho lze použít jako kontrolu funkce barviva uvnitř buňky.

Další podmínkou pro použití jakékoliv látky v živých buňkách je její nízká či žádná toxicita. Vědci tuto vlastnost sledovali v obou použitých buněčných liniích a zjistili, že životaschopnost buněk po aplikaci barviva RB1 nebyla prakticky vůbec ovlivněna.

Závěrem je tedy možné říct, že se českým vědcům podařilo představit první fluorescenční barvivo, které umožňuje selektivní zobrazení amyloidních fibril v cytoplazmách živých buněk. Tento objev by nyní mohl být využit ke studiím mechanismu nejen Parkinsonovy choroby a mohl by tak vnést světlo nejen do zkoumaných buněk ale i do vzniku tohoto onemocnění.

Magda Křelinová

Pankaj Gaur, Maksym Galkin, Andrii Kurochka, Subrata Ghosh, Dmytro A. Yushchenko, and Volodymyr V. Shvadchak; ACS Chemical Neuroscience 2021 12 (8), 1293-1298