Kvasinko, kvasinko, ukaž mi...

Co si člověk může pod pojmem biosenzor představit?
Biosenzory, čili biologické senzory, se skládají jednak z prvku biologického původu (např. proteinu, nukleové kyseliny nebo celé buňky) a nějakého fyzikálně-chemického převodníku signálu. Optické biosenzory fungují např. tak, že  pomocí optického vlákna snímají fluorescenci bakterií. Mohou třeba zaznamenávat snižující se fluorescenci v přítomnosti těžkých kovů. Naše biosenzory jso

u speciální v tom, že obsahují jen biologickou složku. V našem případě je to založeno na tom, že kvasinky (které jsou imobilizované v alginátových kuličkách) v přítomnosti měďnatých iontů zčervenají a člověk to může vyhodnotit zrakem. Samozřejmě by to šlo vyhodnotit i spektrofotometricky - zjišťováním intenzity zbarvení pomocí přístroje, ale my jsme to chtěli mít co nejjednodušší, takže to lze hodnotit jenom zrakem, případně analýzou obrazu.

Jakým způsobem jste dosáhli zčervenání kvasinek?
Jedná se o mutaci v dráze syntézy adeninu, konkrétně deleci genu ADE1 nebo ADE2. Když se pak kvasinka snaží syntetizovat adenin a dráha je přerušená, tak se syntetizuje meziprodukt, který v přítomnosti kyslíku zčervená a hromadí se ve vakuolách. Kvasinky jsou tedy červené, pokud jsou na vzduchu a pokud není dostupný adenin např. z kultivačního média. To by pak neměly potřebu ho systetizovat a nehromadil by se požadovaný meziprodukt. Takovéto mutace jsou už hodně dlouho známé.

A jak jste dosáhly toho, že jsou kvasinky citlivé právě na měď?
Profesorka Z. Palková a doktorka L. Váchová vymyslely, že pokud se do té dráhy na začátek vloží tzv. indukovatelný promotor, tak dráha bude probíhat např. jen v přítomnosti mědi. Takže za její přítomnosti jsou červené a pokud není dostupná, tak se celý proces zastaví hned na začátku a ke zčervenání nedojde. Výhodou je, že tento postup je univerzální - dají se použít různé indukovatelné promotory, takže se dá detekovat i jiná látka.

Jak rychle k vybarvení buněk dochází?
Když mají kvasinky dostupnou měď, tak začnou metabolizovat a my je musíme 17-24 hodin nechat vyrábět adenin a to téměř anaerobně. Tudíž meziprodukt sice vzniká, ale nezčervená. Až ve chvíli, kdy se kultura to okysličí, třeba třepáním, tak kvasinky během pěti minut začnou červenat. Pokud člověk chce dobře vyhodnotit intenzitu zbarvení, tak je potřeba vyhodnotit zabarvení kvasinek do 60 minut po okysličení. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci přítomné mědi (v rozmezí 1-100 μmol).

Zbarvení detekčního kmene při různých koncentracích mědi a různou dobu (15 a 60 min) po okysličení, foto: Irena Vopálenská.

Pokud bychom tedy nepozorovali kvasinky během prvních 60 minut, mohli bychom pak výsledky špatně interpretovat?
Pokud bychom hodnotili zabarvení později (např. po 2 hodinách), nepozorovali bychom rozdíl ve zbarvení kvasinek kultivovaných v přítomnosti např. 50 μmol a 100 μmol mědi, protože v obou případech by už zbarvení dosáhlo nejvyšší možné intenzity. Nízké hodnoty, např. limitní hodnota pro pitnou vodu (15,7 μmol), by se vyhodnotit daly.

Ve svém článku tvrdíte, že metoda dává stejně dobré výsledky jako v současnosti využívané přístroje. Je tedy už připravená ke komerčnímu použití nebo je potřeba ji ještě doladit?
Metoda je patentovaná. Spolupracovali jsme s firmou LentiKat's, která se zabývá imobilizovanými kvasinkami, a ta zkoušela, jak by se to dalo prakticky využít. Jde ale o to, že se pracuje s geneticky modifikovanými organismy, se kterými nelze jen tak volně nakládat. Firma společně s námi vypracovala certifikovanou metodiku pro použití v praxi. Kvasinky bychom mohli dodávat v uzavřené lahvičce, do které by se přidala testovaná voda, vyhodnotily se výsledky a pak by se to předepsaným způsobem zneškodnilo. Protože se hodnota odhaduje přibližně, nelze změřit úplně přesné koncentrace. Ale mohlo by to být užitečné např. v podniku, který vypouští znečištěnou vodu a potřebuje průběžně kontrolovat její kvalitu. Po nakalibrování by mohli sledovat, jak se kvalita vody mění a jestli jsou koncentrace stále v bezpečném rozmezí.

Budete metodiku nějak dále rozvíjet?
Na testování v poloprovozu pracují kolegové, partneři projektu. My se teď chceme zaměřit na testování promotoru s kadmiem. Pro biosenzor detekující kadmium předpokládáme širší využití, protože v české přírodě jsou přece jenom o něco větší potíže s kadmiem než s mědí.   

Vopálenská, I., Váchová, L., Palková, Z. (2015). New biosensor for detection of copper ions in water based on immobilized genetically modified yeast cells. Biosensors and Bioelectronics 72: 160-167.

Radka Zelená