Když dva dělají totéž, není to totéž
Čeští vědci popsali úspěšnou přípravu enzymu α-N-acetylgalaktosaminidasy z Aspergilla niger v Saccharomyces cerevisiae. Kvasinky přitom ze stejného genu vyrábí tento protein trochu jinak než plíseň a není to vůbec na škodu.
Přestože nejrůznějších enzymů hydrolyzujících selektivně vazby mezi dvěma sacharidovými jednotkami je celá řada a můžeme je najít napříč všemi zástupci života, těch které odbourávají terminální α-N-acetylgalaktosamin je v současné době popsáno jen několik. Nejen proto nedávno objevená a charakterizovaná α-N-acetylgalaktosaminidasa (α-N-GalNAcasa) z plísně Aspergilla niger podnítila snahu o přípravu tohoto enzymu pomocí již zavedených technik.
Autoři níže uvedené práce popisují úspěšnou přípravu tohoto enzymu pomocí rekombinantní exprese v Saccharomyces cerevisiae (kvasinka pivní). Ptáte se, co je rekombinantní exprese? Inu, metodami molekulární biologie je z přirozeného organismu vyjmut objevený gen kódující protein našeho zájmu - tedy gen pro α-N-GalNAcasu z Aspergilla niger. Tento je následně vložen do buněk snadno kultivovatelného a přitom dobře popsaného organismu – v našem případě padla volba na Saccharomyces cerevisae. Takto geneticky modifikovaný organismus je následně přinucen, aby „cizí“ gen překládal a vyráběl požadovaný protein.
- Mrázek H. a kol.: Snímky pořízené elektronovým mikroskopem ukazují negativně barvenou α-N-GalNAcasu vyrobenou Aspergillem niger (A, C) v monomerní formě a produkovanou v Saccharomyces cerevisiae (B, D) převážně ve formě dimeru. Zvětšení je u všech snímků stejné, bílé měřítko v panelu D ukazuje 50 nm.
Při následné charakterizaci připraveného rekombinantního proteinu se ukázalo, že pH optimum je oproti protějšku z původního organismu posunuto více do neutrální oblasti. To je z hlediska jeho využití např. v medicínském průmyslu jedině dobře a předurčuje tak tento enzym pro přeměnu červených krvinek skupiny A na univerzálně datovatelnou skupinu 0. Možné vysvětlení se nabídlo vzápětí. Ukázalo se totiž, že Saccharomycety produkují tento enzym převážně v dimerní formě, zatímco Aspergillus niger čistě ve formě monomeru. Dimerní podoba rekombinantní α-N-GalNAcasy byla ověřena pomocí metod analytické ultracentrifugace, elektronové mikroskopie a dynamického rozptylu světla (Tyto metody jsou samy o sobě vzrušujícími světy, a vybízím horlivé čtenáře se zájmem o problematiku k jejich důkladnému průzkumu).
Tato fyzická odlišnost má nejspíše na svědomí i tuto příznivou změnu chemických vlastností. Proč ale Saccharomycety produkují tu stejnou věc poněkud jinak? Jedním z možných vysvětlení je fakt, že Aspergillus niger tento enzym přirozeně sekretuje ze svých buněk do vnějšího prostředí. Při produkci v kvasinkách se ale α-N-GalNAcasa hromadí v buňkách. Vysoké koncentrace v částech buňky se speciálním mikroprostředím (různé pH, redoxní potenciál) pak mohou napomáhat vzniku dimerní formy.
Popsaná příprava ukazuje jak snadno a ve vyšším výtěžku připravit α-N-GalNAcasu z Aspergilla niger v Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantní α-N-GalNAcasa se přitom vyskytuje převážně v dimerní formě, což ji propůjčuje příznivější vlastnosti z hlediska praktického využití.
-Jan Bláha
Akce dokumentů