Jak zjistit vlastnosti variant viru hepatitidy C?

Virus hepatitidy typu C (zkráceně HCV) napadá převážně jaterní buňky a způsobuje závažná jaterní onemocnění. Chronickou infekci HCV zpočátku neprovází žádné příznaky, může během ní ale docházet k postupnému poškození jaterní tkáně, které v nejhorších případech vede až rozvoji rakoviny jater.

Virus HCV tvoří proteinové částice, ve kterých je uschován virový genom tvořený molekulou RNA (obrázek). Podle odlišností v genetické informaci vědci rozlišují 7 různých genotypů HCV a dále více než 70 subtypů. Varianty virové RNA vznikají během replikace viru, když je tvořena RNA pro nově vznikající virové částice. Během kopírování genetické informace totiž dochází k chybám. Vznikají tak virové částice, jejichž RNA se od sebe liší. I v jediném pacientovi tak můžeme najít směs odlišných variant viru HCV.

Virus hepatitidy typu C tvoří proteinové částice. Uvnitř částice je ukrytá virová genetická informace neboli virová RNA. Zdroj: commons.wikimedia.org

Nové varianty virové RNA vznikají velice rychle a mohou ovlivňovat vlastnosti viru jako je jeho schopnost způsobit onemocnění nebo odolávat používaným lékům. To pak představuje problém v léčbě hepatitidy typu C. V posledních letech sice byly vyvinuty účinné léky proti HCV, ovšem téměř okamžitě se objevily také varianty viru schopné těmto léčivům odolávat.

Vědci z Přírodovědecké fakulty UK se zaměřili na studium odlišností v takzvané IRES oblasti genomu HCV. Názvem „IRES oblast“ je označována část sekvence virové RNA, která je nezbytná pro tvorbu virových proteinů a také pro replikaci virové RNA. Díky tomu tato regulační oblast hraje klíčovou roli v replikačním cyklu viru.

V minulosti byly publikovány studie, jejichž autoři se snažili zjistit, zda přítomnost konkrétních mutací v IRES oblasti ovlivňuje úspěšnost léčby pacientů. Tyto studie ale měly rozporuplné výsledky a jednotlivé práce se mezi sebou neshodly, zda takový vztah existuje.

Tým pracovníků z laboratoře doktora Martina Pospíška se proto nejprve rozhodl podrobit analýze data právě z dříve publikovaných prací. Bioinformatická analýza těchto dat ukázala, že výskyt mutací v IRES sekvenci je u pacientů náhodný bez ohledu na to, zda se jedná o pacienty, u kterých léčba účinně zabírá, či nikoliv. Vědci z Karlovy univerzity se proto rozhodli dále nesoustředit na konkrétní mutace v IRES oblasti. Místo toho se zaměřili na to, jak zjistit vlastnosti IRES oblastí přítomných v pacientovi. Výzkumný tým potom vyvinul novou metodu, která umožňuje porovnávat aktivitu jednotlivých IRES sekvencí.

Autoři studie izolovali RNA ze vzorků krve tří pacientů infikovaných HCV a připravili takzvanou knihovnu virových IRES oblastí. Jak již bylo zmíněno, IRES sekvence kontroluje mimo jiné i syntézu virových proteinů. Této vlastnosti vědci využili. IRES sekvence, které izolovali z krve pacientů, vložili do DNA vektorů (označovaných jako plazmidy) obsahujících gen kódující fluorescenční protein EGFP. Tvorba fluorescenčního proteinu se tak ocitla pod kontrolou virových IRES sekvencí.

Připravené DNA konstrukty byly vloženy do buněk metodou transfekce a tvorba fluorescenčního proteinu EGFP pak byla sledována pomocí průtokové cytometrie – metody, která umožnuje měřit fluorescenci jednotlivých buněk. Díky tomu mohli vědci posuzovat aktivitu jednotlivých IRES sekvencí na základě toho, jak účinně byl syntetizován fluorescenční protein.

Díky této analýze vědci zjistili, že v aktivitě IRES sekvencí jednotlivých pacientů jsou rozdíly. Například pozorovali, že u pacientky, která prošla několika cykly neúspěšné léčby, je aktivita IRES sekvencí nižší, než u pacientů u kterých dosud léčba nebyla zahájena. Jedním z možných vysvětlení je, že během neúspěšné léčby byl na virus vyvíjen selekční tlak, který vedl ke vzniku méně aktivních virových variant. Je možné, že by nižší aktivita IRES sekvencí mohla představovat diagnostický nástroj, predikující nižší úspěšnost léčby. Aby však mohly být z těchto dat vyvozeny závěry, je nezbytné provést další experimenty na větším vzorku pacientů.

Autoři práce tak vyvinuli metodu, díky které je možné porovnávat diverzitu mezi IRES sekvencemi v daném pacientovi i srovnávat aktivitu jednotlivých IRES sekvencí. Vědci doufají, že analýza všech virových variant přítomných v pacientovi nám v budoucnu umožní onemocnění lépe porozumět.

Vopálenský V, Khawaja A, Rožnovský L, Mrázek J, Mašek T, et al. Characterization of Hepatitis C Virus IRES Quasispecies - From the Individual to the Pool. Front Microbiol 2018;9:731.

Karolína Pokorná