E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Od atomu k NK buňce: příběh nečekané proteinové struktury

Objev zvláštní proteinové struktury a snaha o její potvrzení vedly k popsání interakčních shluků receptorů na NK buňkách. Studie výzkumných týmů Dr. Ondřeje Vaňka z Katedry biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy a Dr. Jana Dohnálka z Biotechnologického ústavu AV ČR (BIOCEV) byla nedávno publikována v prestižním časopise Nature Communications.

V Laboratoři strukturní biochemie imunitního rozpoznávání, kterou vede doktor Ondřej Vaněk, vznikl zajímavý příběh. Všechno začalo před několika lety pozorováním nečekané proteinové struktury receptoru a skončilo detailním popisem některých struktur a interakcí imunitního systému. „Zajímá nás, jakým způsobem buňky imunitního systému rozeznávají, jestli jsou jiné buňky v našem těle zdravé nebo nezdravé (nádorové, virem napadené, stresované, či nějakým způsobem poškozené),“ přibližuje Dr. Vaněk. Jeho výzkumný tým se zaměřuje především na NK buňky (z anglického natural killer cells), které jsou součástí vrozené imunity a pokud seznají, že jiná buňka v těle není v pořádku, mají schopnost ji poměrně rychle zabít. Strukturní imunologie se zde snaží odhalit, jakým způsobem receptory na povrchu buněk imunitního systému rozpoznávají proteiny (nebo jiné struktury) na povrchu jiné buňky. „Tyto proteiny NK buňce řeknou, zda je nebo není vše v pořádku. To, co se nakonec stane, není jen o interakci dvou proteinů, ale jedná se souhru celé řady interakcí, a nakonec převáží buď inhibiční, nebo aktivační signál,“ popisuje Dr. Vaněk.

Obrázek 1 – Dr. Ondřej Vaněk, Laboratoř strukturní biochemie imunitního rozpoznávání, PřF UK.

 

Obrázek 2 – Dr. Jan Dohnálek, Laboratoře struktury a funkce biomolekul BTÚ AV ČR, BIOCEV.

 

Právě publikovaná práce se zaměřuje na dva proteiny a jejich interakci. Jedním z nich je receptor na NK buňkách, označovaný jako NKR-P1. Tento receptor je zajímavý mimo jiné tím, že byl objeven již v 80. letech, nejprve u myši a jen o málo později u člověka, a dodnes slouží jako jeden z hlavních povrchových znaků, jímž lze NK buňky definovat. Zatímco u hlodavců těchto NKR-P1 proteinů najdeme více (jsou polymorfní), u člověka byl popsán jen jeden a jeho struktura dosud nebyla známa. U NK buněk je funkce receptoru NKR-P1 inhibiční, avšak najdeme ho i na povrchu některých specifických subpopulací T lymfocytů, které jsou skloňovány v souvislosti s celou řadou autoimunitních onemocnění a v tomto kontextu není zatím jeho působení moc dobře popsáno. Pravděpodobně se mění z čistě inhibičního na kostimulační a přispívá tak k rozvoji těchto onemocnění.

Druhým proteinem, na který se studie zaměřuje, je ligand receptoru NKR-P1, protein LLT1. Tento protein se za normálních okolností vyskytuje na dalších buňkách imunitního systému a jak popisuje Dr. Vaněk: „Při interakci a vzájemném osahání povrchu si díky němu buňky řeknou, že o sobě ví a všechno je v pořádku.“ Posledních patnáct let se však ukazuje, že v řadě případů nádorového bujení je protein LLT1 exprimován na povrchu rakovinných buněk. Pod evolučním tlakem buněk imunitního systému se nádor snaží najít nějakou cestu, jak uniknout imunitnímu dohledu. V tomto případě začaly rakovinné buňky na svém povrchu exprimovat protein LLT1, aby inhibovaly imunitní odpověď. „Bohužel platí, že čím horší typ nádoru, tím více nacházíme povrchovou expresi proteinu LLT1. Mohli bychom říci, že se jedná o špatný prognostický marker – když nalezneme tento protein, není to úplně dobrý signál, protože pro imunitní systém bude pravděpodobně těžší se s nádorem vypořádat.“ dodává Dr. Vaněk. Strukturu LLT1 popsali společně s kolegy z BTÚ AV ČR jako první v roce 2015.

Obrázek 3 – Struktura lidského NKR-P1 ukazuje unikátní dimerizační rozhraní. Panel (a) zobrazuje srovnání krystalových struktur dimerů vazebné domény receptoru NKR-P1 tvořených glykosylovanou (tyrkysová), deglykosylovanou (zelená) a LLT1-vázanou (modrá) formou NKR-P1. Helix α1 je vyznačen červeně, helix α2 žlutě. Dimer NKR-P1 je ve všech třech případech tvořen zcela shodně s využitím helixu α1. Panel (b) zobrazuje strukturní srovnání dimerů LLT1 (zeleně) a NKR-P1 (tyrkysově) připravené překrytím pouze jednoho monomeru z každého dimeru (uprostřed). Ačkoli je tvar vazebné domény obou proteinů velmi podobný, způsob jejich dimerizace je zcela opačný zatímco molekuly NKR-P1 se k sobě pojí přes červený helix α1, v případě LLT1 je tomu přes žlutý helix α2. I díky této odlišnosti spolu mohou oba proteiny v komplexu tvořit níže zmíněné řetězovité uspořádání.

 

Článek popisuje oba proteiny a jejich interakci na mnoha rovinách – od atomární struktury až po rovinu buňky. Výzkumný tým nejdříve vyrobil příslušné proteiny, vykrystalizoval a popsal strukturu jejich komplexu. „Výsledek byl poměrně nečekaný a zajímavý. Člověk si v tu chvíli říká, zda je to jenom artefakt krystalu, nebo taková struktura na povrchu buňky opravdu existuje.“ popisuje Dr. Vaněk. Dalším, poměrně složitým, krokem výzkumu byla superrozlišovací mikroskopie. Studovaný proteinový komplex má totiž poměrně nízkou afinitu, a tak už jenom pozorovat tuto interakci v roztoku nebylo jednoduché. Následující fáze výzkumu probíhaly na povrchu buňky a na živých buňkách izolovaných z krve dárců. Díky kombinaci mnoha metod dokázal výzkumný tým ověřit předchozí pozorování v krystalové struktuře komplexu obou proteinů a popsat z toho vyplývající funkční konsekvence – za jakých podmínek se spolu musí proteiny NKR-P1 a LLT1 potkat, aby vznikl inhibiční signál. Jeden ze spoluautorů studie, Mgr. Denis Cmunt, nyní PhD. Student na Univerzitě Lausanne, popisuje: Nejzajímavější bylo propojení dat na různých úrovních. Bylo krásné vidět, jak do sebe vše nakonec zapadlo, jak byla biofyzikální pozorování učiněná na molekulárních systémech potvrzena i v pokusech s buňkami.

Receptor NKR-P1 i jeho ligand LLT1 jsou homodimery, to znamená, že se na povrchu dané buňky nachází vždy dva stejné řetězce, spojené pomocí disulfidických můstků. Dosud platila představa, že při vzájemné interakci obou proteinů váže jeden dimer receptoru jeden dimer ligandu. Díky krystalové struktuře komplexu NKR-P1 s LLT1 však víme, že to není pravda: polovina dimeru receptoru interaguje s polovinou dimeru ligandu. Vzniká tak síť vzájemně provázaných molekul, která evokuje možnost existence vazebných shluků těchto molekul na povrchu NK buňky při její interakci s buňkou cílovou. Ověřit tuto hypotézu však nebylo úplně triviální a potvrdit ji od atomu až na úroveň buňky trvalo několik let usilovného výzkumu, do kterého se zapojila i celá řada studentů. Afinita studovaných proteinů je velmi slabá a teprve díky využívání dvou různých interakčních povrchů a shlukování dimerů zesílí natolik, aby NK buňka vzala inhibiční signál v potaz. Nezbytnost setkání většího počtu molekul je tak jakousi evoluční ochranou před zbytečnými či falešnými podněty a díky nové studii přesně vidíme, jak tato interakce na strukturní úrovni funguje. Detailní popis strukturních a funkčních vlastností pak teoreticky umožňuje navrhnout terapeutické proteiny, které by mohly do výše popsaného systému uměle zasáhnout a žádoucím způsobem ovlivnit interakci imunitního systému a nádorových buněk. Například by mohly od nádorové buňky k NK buňce vyslat úplně opačný signál a místo inhibice aktivovat programovanou buněčnou smrt.

Obrázek 4 – Uspořádání komplexů NKR-P1:LLT1 na povrchu buněk. Panel (a) zobrazuje uspořádání sousedních molekul v krystalu komplexu NKR-P1:LLT1, v němž dimery NKR-P1 (modrá a tyrkysová) a LLT1 (zelená a limetková) vytvářejí řetězcovou strukturu. Vpravo schematické znázornění tohoto uspořádání, kde černé a bílé trojúhelníky představují pozice N-konců proteinů směřujících k buněčné membráně za a před rovinu zobrazení. Panel (b) zobrazuje uspořádání řetězovité struktury při kontaktu NK buňky (dole, modrá) s cílovou buňkou (nahoře, zelená), které ukazuje krystalovou strukturu dvou dimerů NKR-P1 (modrá a tyrkysová) interagujících se dvěma dimery LLT1 (zelená a limetková). N-konce proteinů ve strukturách jsou zvýrazněny červeně a pružné oblasti proteinů spojující extracelulární vazebné domény s jejich intracelulární částí jsou znázorněny jako skvrnité čáry vnořené do buněčné membrány. Pohled na pravé straně je pro přehlednost oříznut v rovině naznačené na pohledu vlevo. Panel (c) znázorňuje dynamiku receptoru NKR-P1 a jeho vazebných uspořádání s ligandem LLT1. Oba proteiny jsou vyjádřeny jako disulfidicky vázané homodimery, vazebná doména receptoru NKR-P1 však může podléhat konformačním změnám typu monomer-dimer, což je dále umocněno v případě některých alelických variant tohoto receptoru. Dimer NKR-P1 pak může interagovat s ligandem LLT1 v dříve navrženém modelu “jeden na jednoho” nebo vytvořit řetězovité uspořádání jako v krystalové struktuře komplexu NKR-P1:LLT1. Díky superrozlišovací mikroskopii a sledování aktivity NK buněk bylo možno prokázat, že k tomuto řetězení skutečně dochází i na povrchu buňky a že je zcela zásadní pro inhibiční signalizaci receptoru NKR-P1.

 

Projekt byl realizován pod vedením týmu Dr. Ondřeje Vaňka z Laboratoře strukturní biochemie imunitního rozpoznávání PřF UK se zásadními příspěvky Dr. Jana Bláhy v podobě přípravy vzorků, jejich krystalizace a výpočetní analýzy strukturních dat, a Dr. Barbory Kalouskové v oblasti experimentů superrozlišovací mikroskopie a funkční analýzy NK buněk. Tým Dr. Jana Dohnálka z Laboratoře struktury a funkce biomolekul BTÚ přispěl vyřešením krystalových struktur a analýzou dat maloúhlového rentgenového rozptylu, s hlavním podílem Dr. Terezy Skálové na strukturních pracích. K výzkumu významně přispěli také dva pracovníci z Univerzity v Oxfordu, kde probíhala krystalizace a měření rentgenové difrakce. „Z naší laboratoře se na této studii podílelo několik generací studentů a její první autor, Jan Bláha, na tomto výzkumu udělal doktorát. Postupně jsme se učili další a další metody a studenti se díky tomu opravdu hodně posunuli. Někteří z nich teď pracují na špičkových evropských pracovištích.“ Vysvětluje Dr. Vaněk a dodává: „Za mě je to skutečně velká část toho příběhu, protože kdyby v naší laboratoři nebyli nadaní studenti, kteří do toho dali kus života a sebe, tak já sám bych toho mnoho nedokázal.“

Dr. Jan Bláha, první autor studie a nyní postdoktorand v EMBL Hamburk k výzkumu dodává: „Při práci na tomto projektu pro mě bylo nejzajímavější objevovat nové poznatky v relativně běžných datech, které nás vedly ke složitějším experimentům, které tyto poznatky potvrdily. Naučil jsem se nebát se následovat vlastní bláznivé myšlenky, pokud se opírají o získaná data. Pochopil jsem, že řada světových odborníků jsou jenom lidé, a ti nejzapálenější jsou hraví a ochotní pomoci s každou bláznivou vědeckou myšlenkou.

Další klíčová spoluautorka, Dr.Barbora Kalousková, která nyní působí jako postdoktorandka na Technické Univerzitě ve Vídni, výroky svých kolegů dále rozvádí: „Nejtěžší bylo prokousat se přes prvotní neúspěchy k fungujícím a reprodukovatelným výsledkům. Občas je těžké odlišit, jestli experiment nefunguje kvůli špatnému nastavení nebo pro to, že je základní hypotéza špatná, a tedy nikdy ani fungovat nemůže. To byl hlavně problém při optimalizaci pro nás do té doby nových metod, jako byla superrozlišovací mikroskopie a cytotoxické testy s primárními NK buňkami. Myslím, že jsem se díky této studii naučila hledat cesty. A to ve smyslu ne těch nejjednodušších, ale naopak složitějších, i když stále schůdných. Máme kolem sebe až překvapivé množství špičkově vybavených pracovišť, stačí jen najít ty správné přístroje a oslovit jejich šikovné operátory. Nebo se to prostě naučit a operovat s přístrojem sám. A nebát se mezioborové spolupráce.“

Vedoucí Laboratoře struktury a funkce biomolekul, Dr. Jan Dohnálek z Biotechnologického ústavu AV ČR, komentuje strukturní analýzu projektu: „Strukturní evidence tvorby komplexu si vyžádala důkladnou analýzu dat, což podtrhuje nezbytnost vysoké úrovně strukturní expertízy pro takový projekt. Není bez zajímavosti, že náznaky strukturních výsledků ohledně klastrování receptorů a ligandů se jevily jako obtížně prokazatelné a obhajitelné, co se týká jejich biologického významu. Bylo to ale nakonec díky velkému úsilí spolupracovníků z Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy, že se podařilo prokázat i jejich biologický význam.“

Výzkum podpořila mimo jiné Grantová agentura České republiky, Grantová agentura Univerzity Karlovy a MŠMT ČR. Kritickým přínosem byla možnost vyslat nejen vzorky, ale i studenty na pracoviště Univerzity v Oxfordu, kde díky tomu proběhly klíčové experimenty. Bylo to umožněno díky evropské platformě pro strukturní biologii Instruct-ERIC, jejíž součástí je i Centrum molekulární struktury BIOCEV, vedené spolupracovníky a spoluautory studie z BTÚ AV ČR.

Odkaz na publikaci:

Bláha J., Skálová T., Kalousková B., Skořepa O., Cmunt D., Grobárová V., Pazicky S., Poláchová E., Abreu C., Stránský J., Kovaľ T., Dušková J., Zhao Y., Harlos K., Hašek J., Dohnálek J., Vaněk O. (2022): Structure of the human NK cell NKR-P1:LLT1 receptor:ligand complex reveals clustering in the immune synapse. Nature Communications 13(1): 5022. DOI: 10.1038/s41467-022-32577-6

Publikováno: Pondělí 19.09.2022 07:10

Akce dokumentů