E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Sekvenování proteinů

Stanovení N-terminální sekvence proteinů a peptidů metodou automatického Edmanova odbourávání na sekvenátoru proteinů firem PORTON/Beckman-Coulter a Applied Biosystems

Princip metody. Vzorek proteinu nebo peptidu je imobilizován na PVDF membráně, nebo se v případě rozpustných vzorků nanese na filtr ze skleněných vláken upravený pomocí BioBrenu (napomáhá udržení vzorku na membráně). Vzorek je umístěn do reakční nádoby přístroje, a podroben opakovaným reakcím Edmanova odbourávání: reakce vzorku s fenylisothiokyanátem probíhá v alkalickém prostředí aminu, který je poté odpařen, a probíhá odštěpení N-koncové aminokyseliny v kyselém prostředí bezvodé kyseliny trifluoroctové. Uvolněný ATZ derivát aminokyseliny je extrahován nevodnými solventy (ethylacetát, 1-chlorobutan), přenesen do konverzní nádobky, a po odpaření rozpouštědel probíhá přeměna na stabilní PTH derivát aminokyseliny. Ten je poté identifikován pomocí HPLC systému on line. U vzorků analyzovaných na proteinovém filtru lze identifikovat až 50 N-terminálních aminokyselin, u PVDF blotů cca 30 reziduí. V každém případě je kvalita získané sekvence závislá na konkrétním vzorku, a může se tedy vzorek od vzorku lišit (výše uvedené údaje jsou pouze orientační).

Interpretace výsledků. PTH aminokyseliny identifikované v jednotlivých cyklech jsou identifikovány chromatograficky, a N-terminální aminokyselinová sekvence se přečte srovnáním chromatogramů ze dvou po sobě následujících cyklů. Identifikovány jsou všechny kódové aminokyseliny s výjimkou cysteinu, který je v průběhu reakcí Edmanovy chemie degradován (viz. níže). U homogenních vzorků je identifikace proteinů jednoznačná, rozlišení isobarických aminokyselin (leucin, isoleucin) nepředstavuje žádný problém. Často lze identifikovat i vzorky, které nejsou homogenní, a to pomocí kvantifikace jednotlivých cyklů.

Příprava vzorků. Vzorek lze zasílat k analýze ve formě PVDF blotu (zóna proteinu na PVDF membráně pozitivní při barvení Coomassie Briliant Blue R-250), nebo ve formě lyofilizovaného vzorku zbaveného veškerých solí a pufrů. Příprava vzorků ve formě PVDF blotů má několik výhod: analyzovaný protein nemusí být homogenní (k přečištění dojde při SDS elektroforese), intenzivním promytím PVDF membrány lze protein účinně odsolit a analýza je cenově výhodnější (nemusí se provádět tzv. Precycling). Technika přípravy PVDF blotů je však kritická: identické množství proteinu soustředěné na malé ploše PVDF membrány poskytuje výrazně lepší výsledky než totéž množství rozprostřené přes velkou plochu.

Související nabízené služby. Na přání zákazníků a po předběžné osobní domluvě lze dále rozšířit spektrum nabízených analytických služeb takto: příprava vzorku pro sekvenci, modifikace cysteinů in sequencio, sekvenace peptidů imobilizovaných na jiných nosičích (polystyren, jiné polymery - nikoliv nitrocelulosa !!!), chemické odblokování N-terminálního konce (vhodné pro bakteriální proteiny), enzymatické odblokování N-terminálního konce, utajení výsledku.

Kontaktní osoba:

Doc. RNDr. Helena Ryšlavá CSc.,  Tel. 221951282 ryslava@seznam.cz

Finanční náročnost analýzy:

Zákazníci z akademických pracovišť: cena na vyžádání

Komerční zákaznící                            cena na vyžádání

Speciální služby:                                  dle dohody

Platba se provádí bankovním převodem ve prospěch  účtu, jehož nositelem je UK PřF. K úhradě většinou dochází z grantových projektů akademických zákazníků, položka „SLUŽBY“.

Tato analýza je finančně dosti náročná – je to dáno vysokou pořizovací cenou přístroje (cca 5 mil. Kč), vysokými náklady na jeho provoz (servisní kontrakt 400 tis. Kč ročně), a cenou používaných chemikálií (reprodukovatelné výsledky lze zaručit jen při použití originálních chemikálií firmy AB).

Sekvenátor proteinů obrázek
 

Obr. 1. Sekvenátor proteinů PROCISE 491 firmy Applied Biosystems. V levé části obrázků je procesorově řízený systém provádějící reakce automatického Edmanova odbourávání. Vzorek se vkládá do reakční patrony (vlevo nahoře), v levé spodní části jsou zásobníky na jednotlivé chemikálie nezbytné pro provádění Edmanovy chemie. Po konverzi jsou vzniklé PTH aminokyseliny identifikovány on line po separaci na HPLC s využitím kolony s reverzní fází a spektrofotometrické detekce (vpravo).

Akce dokumentů