E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Sedimentační analýza

 

Stanovení sedimentačního koeficientu a molární hmotnosti makromolekul metodou sedimentační rychlosti resp. sedimentační rovnováhy pomocí analytické ultracentrifugy ProteomLab XL-I firmy Beckman Coulter

Princip metody. Vzorek makromolekuly (nejčastěji proteinu, může jím být ovšem libovolná částice s hmotou v rozsahu cca 1 kDa až 1 MDa) umístěný ve speciální optické kyvetě je vystaven odstředivé síle v rotoru ultracentrifugy a jeho sedimentace ve vzniklém tíhovém poli je sledována pomocí dvou nezávislých optických systémů využívajících jednak interference laserových paprsků procházejících vzorkem či změny absorbance vzorku v závislosti na jeho sedimentaci. Záznamem je profil sedimentace proteinu v závislosti na poloměru otáčení a změna tohoto profilu během experimentu – časová závislost sedimentace. Sedimentačně rychlostní experiment využívá jevu, kdy při dostatečně vysokém přetížení veškeré molekuly proteinu sedimentují ke dnu kyvety a můžeme tak pozorovat pohybující se sedimentační rozhraní. Sedimentačně rovnovážný experiment je veden tak, že necháme při menším přetížení ustavit termodynamickou rovnováhu mezi sedimentací a difúzí, což se projeví neměnným sedimentačním rozhraním. V současnosti disponujeme titanovým rotorem AnTi50 s maximem 50000 otáček za minutu a kyvetami pro současnou analýzu až tří vzorků pro oba typy experimentů. Metoda umožňuje v principu i stanovení směsi dvou a více látek, které spolu mohou i navzájem interagovat (např. rovnováha monomer-dimer, receptor-ligand, apod.), event. i určit rovnovážnou konstantu interakce. Takovéto závislosti a jiné složitější systémy však může být relativně obtížné interpretovat, rozhodující je vždy kvalita dat odvislá od konkrétního vzorku a jeho přípravy, úroveň interpretace dat se tedy může vzorek od vzorku lišit.

Interpretace výsledků. Primárním výsledkem sedimentačně rychlostního experimentu je přesná hodnota sedimentačního (případně i difúzního) koeficientu dané molekuly, lze pak dále usuzovat i na velikost a tvar molekul. Primárním výsledkem sedimentačně rovnovážného experimentu je molární hmotnost sedimentující látky – zde je nutno si uvědomit, že tato metoda jako jedna z nemnoha umožňuje stanovit molární hmotu přímo, na základě fyzikálních principů, bez nutnosti využití jakéhokoli standardu či kalibrace. Obě metody pak zároveň slouží pro ověření homogenity či heterogenity vzorku, jeho agregace či asociace. Pro přesnou interpretaci dat je nutné znát aminokyselinovou sekvenci proteinu (je-li známa) a složení pufru – lze pak predikovat parciální specifický objem proteinu a přesnou hustotu pufru, klíčové parametry pro vyhodnocení.

Příprava vzorků. Ideální příprava vzorku je dialýza přes noc proti zvolenému pufru, ten by měl vždy obsahovat alespoň 150 mM chlorid sodný či jinou látku, která zajistí podobnou iontovou sílu. Doporučujeme také přidat 10 mM azid sodný jako bakteriostatikum. Vzorek pro sedimentačně rychlostní experiment by měl mít objem 0,5 ml a absorbanci kolem 0,5 při zvolené vlnové délce (lze měřit v rozsahu hodnot absorbance 0,1-1,0 a vlnových délek 190-800 nm, pro vysoké koncentrace lze využít pouze interferenční optiku). Vzorek pro sedimentační rovnováhu by měl mít objem 0,15 ml a absorbanci kolem 0,2; pro oba typy experimentů je třeba ještě dodat pufr (roztok po dialýze, slouží jako reference), raději alespoň několik mililitrů. Analýza může probíhat v rozmezí 4-40°C, nicméně ideální je standardních 20 či 25°C. Vzorek by proto měl být za daných podmínek stabilní v řádu nejméně hodin, lépe dní až jednoho týdne. Vzorky lze po předchozí dohodě a rezervaci přístroje předat nejlépe osobně.

Kontaktní osoba:

RNDr. Ondřej Vaněk, PhD.  Tel. 221951272, 736165679 kenav3@seznam.cz

Pan Jiří Janovský, laborant

Finanční náročnost analýzy:

Zákazníci z akademických pracovišť: 6000 Kč za každý analyzovaný vzorek

Komerční zákazníci:                            20000 Kč za každý analyzovaný vzorek

Platba se provádí bankovním převodem ve prospěch  účtu, jehož nositelem je UK PřF. K úhradě většinou dochází z grantových projektů akademických zákazníků, položka „SLUŽBY“.

Tato analýza je finančně dosti náročná – je to dáno vysokou pořizovací cenou přístroje (cca 10 mil. Kč), vysokými náklady na jeho provoz (servisní kontrakt 400 tis. Kč ročně), a cenou používaných komponent (součásti optických kyvet pro vzorky), které bohužel také podléhají opotřebení a jejichž ceny se pohybují v řádech desítek tisíc Kč.

Analytická ultracentrifuga obrazek Analytická ultracentrifuga rotor obrazek

Obr. 1. Analytická ultracentrifuga ProteomLab XL-I firmy Beckman Coulter. Na první pohled normální ultracentrifuga (horní obrázek) skrývá uvnitř unikátní optické rameno (dolní obrázek) s interferenční i absorbanční optikou, které umožňuje v reálném čase sledovat sedimentaci vzorku v kyvetách se safírovými sklíčky umístěnými v titanovém rotoru.

Akce dokumentů