E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Příprava vzorků

Značení vzorků a příjem materiálu

  • Vzorky dodávejte v označených sáčcích: v Biocevu Vestec do fialově označené schránky vedle recepce nebo ve Viničné 7 do malé lednice ve II. suterénu na chodbě vpravo od výtahu (vzorky se obden převážejí) nebo zašlete poštou na adresu Š. Hrdá, OMICS - PřF UK, Biocev, Průmyslová 595, Vestec, 252 50. Vzorky posílejte v dobře těsnících zkumavkách nebo stripech (ne pod fólií), poštou zásadně zabalené v bublinkách. 
  • Průvodku ( Průvodka A, Průvodka R, Průvodka F, označení je vysvětleno níže) zašlete na adresu seqlab@natur.cuni.cz, v případě potíží s odesíláním na adresu hrda@natur.cuni.cz. Papírové průvodky nemusíte se vzorky posílat. Průvodky se částečně samy vyplňují - pokud ne, stáhněte si je znovu. Vyplňujte je pozorně, jména zásadně ve formátu Příjmení Křestní jméno.
  • Průvodku, sáček se vzorky a předmět e-mailu označte stejně, a to zkratkou jména a datem (např. Štěpánka Hrdá - STH010112).
  • Pokud máte další požadavky, např. spěcháte na výsledky, chcete výsledky na jinou adresu, požadujete speciální podmínky (vyšší/nižší teplotu nasedání, možnou přítomnost vlásenky nebo HisTag sekvence, problémy při předchozí sekvenaci podobného vzorku, použití BigDye® Terminator v1.1 apod.), zapište je jak do průvodky, tak i do emailu.
  • Do průvodky nezapomeňte uvést délku PCR fragmentu, respektive požadovanou délku přečtené sekvence  insertu (do 400 bazí, do 700 bazí, co nejvíc) a také celkovou velikost vektoru. Přizpůsobujeme tomu sekvenační podmínky.
  • Zkumavky se vzorky označujte zkratkou a pořadovým číslem podle průvodky (např. sth1). Názvy vzorků v průvodce mohou být jakékoli, musí ale začínat zkratkou jména (např. STH), smí obsahovat pouze povolené znaky -_ ., a nesmí obsahovat mezeru (viz průvodka).
  •  

    Analýza hotových přečištěných sekvenačních produktů průvodka A

    • Vzorky dodávejte v 0,2 nebo 0,5 ml zkumavkách, řádně vysušené. Zbytky ethanolu narušují analýzu sekvence. Dosušit lze v otevřené zkumavce za cca 5 min. při 50-60°C.

     

    Sekvenační reakce a analýza průvodka R; English version

    • Vzorky připravujte do 0,2 ml tenkostěnných mikrozkumavek, do stripů nebo do platíčka (pipetujte po sloupcích po 8!od sloupce A). Zvláště při větším počtu jednotlivých zkumavek použijte pořadová čísla z průvodky a zkumavky vyrovnejte do stojánku, na karton či podobně (stojánky samozřejmě vracíme, stačí si je podepsat a vyzvednout).
    • Celkový objem je 8 μl =

      - jeden primer v množství 5 pmol, doporučujeme brát 1ul ze zásobního 5 uM roztoku primeru. Tm 50-55°C opt., Tm 45-72°C max., na Tm lišící se od optima vždy upozorněte v průvodce, stejně jako na použití degenerovaných primerů (jejich používání ale spíše nedoporučujeme).

       


      - DNA v množství 5ng/100pb u PCR produktů a 3ng/100pb plasmidové DNA (započítává se celá délka plasmidu), odpovídá 100-200ng do reakce, max. 300ng u velkých plasmidů.

       


      - voda (kvalitní), v žádném případě TE pufr - blokuje reakci!!

      Pokud vám sekvenace chodí dobře, koncentraci samozřejmě neměňte!
    • Často používané primery můžeme do reakce přidat, v tom případě připravte vzorek do objemu 7 μl.
    • Vzorek pro sekvenaci musí být zbaven veškerých nečistot! Pro plasmidy je nejvhodnější použít miniprep kit. Problém může způsobil ethanol ve vzorku, takže je kolonku potřeba před elucí do vody 2x stočit a pořádně odvětrat (5 min). PCR produkty přečistěte buď pomocí kolonek,EsoSapem nebo ethanolovou precipitací (pozor na správnou koncentraci ethanolu).
    • Pokud sekvenujete poprvé, začněte s malým počtem vzorků. S menším počtem začínejte i nové série, např. po delší době nebo s novými primery.
    • Nejčastější problémy jsou z nevhodně zvoleného primeru a špatné koncentrace či čistoty templátu.

     

    Fragmentační analýza průvodka F

    • Vzorky dodávejte ve stripech nebo v optickém platíčku (dostanete předem v laboratoři). Analýza běží na 16ti-kapiláře, snažte se proto, aby počet vzorků byl pokud možno násobkem šestnácti.
    • Vzorky (0,5 μl) namíchejte do formamidu (9 μl, i ten dostanete předem v laboratoři), přidejte vlastní standard (0,5 μl) a zdenaturujte.
    • Vnitřní standardy (ROX400,500 a LIZ120,500,600,1000) nedodáváme.
    • Přístroj má nastaveny spektrální kalibrace se standardy:
    1. DS-30 (6FAM™, HEX, NED™, ROX™) pro červený standard ROX400 a ROX500
    2. DS-33 (6FAM™, VIC®, NED™, PET®, LIZ®) pro oranžový standard LIZ500,LIZ600,LIZ1000
    3. DS-02 (dR110, dR6G, dTAMRA™, dROX™, LIZ®) pro oranžový standard LIZ120 pro SNaPshoty.

     

    Akce dokumentů