Příprava vzorků
Značení vzorků a příjem materiálu
Analýza hotových přečištěných sekvenačních produktů průvodka A
- Vzorky dodávejte v 0,2 nebo 0,5 ml zkumavkách, řádně vysušené. Zbytky ethanolu narušují analýzu sekvence. Dosušit lze v otevřené zkumavce za cca 5 min. při 50-60°C.
Sekvenační reakce a analýza průvodka R; English version
- Vzorky připravujte do 0,2 ml tenkostěnných mikrozkumavek, do stripů nebo do platíčka (pipetujte po sloupcích po 8!od sloupce A). Zvláště při větším počtu jednotlivých zkumavek použijte pořadová čísla z průvodky a zkumavky vyrovnejte do stojánku, na karton či podobně (stojánky samozřejmě vracíme, stačí si je podepsat a vyzvednout).
- Celkový objem je 8 μl =
- jeden primer v množství 5 pmol, doporučujeme brát 1ul ze zásobního 5 uM roztoku primeru. Tm 50-55°C opt., Tm 45-72°C max., na Tm lišící se od optima vždy upozorněte v průvodce, stejně jako na použití degenerovaných primerů (jejich používání ale spíše nedoporučujeme).
- DNA v množství 5ng/100pb u PCR produktů a 3ng/100pb plasmidové DNA (započítává se celá délka plasmidu), odpovídá 100-200ng do reakce, max. 300ng u velkých plasmidů.
- voda (kvalitní), v žádném případě TE pufr - blokuje reakci!!
Pokud vám sekvenace chodí dobře, koncentraci samozřejmě neměňte! - Často používané primery můžeme do reakce přidat, v tom případě připravte vzorek do objemu 7 μl.
- Vzorek pro sekvenaci musí být zbaven veškerých nečistot! Pro plasmidy je nejvhodnější použít miniprep kit. Problém může způsobil ethanol ve vzorku, takže je kolonku potřeba před elucí do vody 2x stočit a pořádně odvětrat (5 min). PCR produkty přečistěte buď pomocí kolonek,EsoSapem nebo ethanolovou precipitací (pozor na správnou koncentraci ethanolu).
- Pokud sekvenujete poprvé, začněte s malým počtem vzorků. S menším počtem začínejte i nové série, např. po delší době nebo s novými primery.
- Nejčastější problémy jsou z nevhodně zvoleného primeru a špatné koncentrace či čistoty templátu.
Fragmentační analýza průvodka F
- Vzorky dodávejte ve stripech nebo v optickém platíčku (dostanete předem v laboratoři). Analýza běží na 16ti-kapiláře, snažte se proto, aby počet vzorků byl pokud možno násobkem šestnácti.
- Vzorky (0,5 μl) namíchejte do formamidu (9 μl, i ten dostanete předem v laboratoři), přidejte vlastní standard (0,5 μl) a zdenaturujte.
- Vnitřní standardy (ROX400,500 a LIZ120,500,600,1000) nedodáváme.
- Přístroj má nastaveny spektrální kalibrace se standardy:
- DS-30 (6FAM™, HEX, NED™, ROX™) pro červený standard ROX400 a ROX500
- DS-33 (6FAM™, VIC®, NED™, PET®, LIZ®) pro oranžový standard LIZ500,LIZ600,LIZ1000
- DS-02 (dR110, dR6G, dTAMRA™, dROX™, LIZ®) pro oranžový standard LIZ120 pro SNaPshoty.
Akce dokumentů