Užitečné informace a odkazy

Naše primery:

· Pro sekvenační reakci používáme kity firmy Applied Biosystems: BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit event. BigDye^® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit vhodný pro kratší PCR produkty (do 300b).

Ke kitu přidáváme enhancing buffer (BDX64, MCLAB) a sekvenační pufr (Applied Biosystems).

Reakce běží 35 cyklů: 10 s­_96 °C, 5 s­_50 °C, 3 min_60 °C.

·  Při Tm primeru větším než 55°C a menším než 48°C modifikujeme  profil reakce.

· Čistíme ethanolovou precipitací s acetátem sodným (3M). Vzorky jsou pro analýzu rozpuštěny v Hi-Di formamidu.

· Analýza probíhá na 50 cm kapilárách na polymeru POP-7 (Applied Biosystems). Optimálně získáváme 800 bází. Kapilární elektroforéza probíhá v prostředí pufru s EDTA .

Návod na řešení nejčastějších problémů při sekvenaci:

Nejpravděpodobnější příčinou selhání sekvenační reakce je špatná kvalita nebo koncentrace templátu nebo nesprávně zvolený primer.

Koncentrace templátu:

5 ng/100pb PCR produktu resp. 3 ng/100pb plasmidové DNA (započítává se celková délka plasmidu) na jednu reakci. Při stejné koncentraci počet cílových míst pro sekvenaci se vrůstající délkou vektoru klesá. Většina DNA, která jde do sekvenace, je v případě plasmidu vlastně irelevantní.

Se sekvenací plasmidů do velikosti 8000 pb nebývají potíže, u delších (zvláště nad 10000 pb) je někdy potřeba upravit koncentraci, pokud napoprvé sekvenace nevyšla. Zvláště u delších plasmidů někdy nastává problém se vznikem supercoil struktury, kdy nadšroubovicové vinutí brání úspěšné sekvenaci (zvláště je-li obsah G+C větší než 60%). V tomto případě doporučujeme plasmid naštěpit ve vhodném místě. U dlouhých plasmidů je možné také udělat PCR reakci se specifickými nebo plasmidovými  primery a sekvenovat až tento produkt. Obdobně doporučujeme postupovat i při sekvenci velkých nízkokopiových konstruktů (BAC, fosmidy, kosmidy), které normálně nesekvenujeme, protože na ně nemáme vypracovanou metodiku (můžeme to ale na vyžádání bez záruky zkusit).

Měření koncentrace pomocí gelové elektroforézy – Zhodnotíte i kvalitu DNA, především to, zda není degradovaná (dosti častý problém!), neobsahuje RNA, primery či jejich dimery, nebo nespecifické fragmenty. Nepoznáte však další kontaminanty (sole, proteiny, rozpouštědla). Přehled naleznete na následujícím odkazu:

http://www.base-asia.com/downloads/products/dna_sequencing/Quality%20Analysis%20of%20DNA%20template%20for%20Sanger%20Sequencing.pdf

Měření koncentrace pomocí Nanodropu –Koncentraci a čistotu templátu si můžete změřit v 2 µl objemu na nanodropu v laboratoři S003 v II. suterénu v Laboratoři sekvenace DNA. Měření je rychlé a v rozmezí 10ng – 1000ng i celkem spolehlivé. Při měření kontrolujte index 260/280 i 260/230. Oba indexy by měly být větší než 1,8. Nízký index 260/230 svědčí o kontaminaci solemi nebo rozpouštědly, nízký index 260/280 o kontaminaci proteiny. Pozor při měření nízkých koncentrací, bývá zde větší chyba. Vzorky by při měření měly mít pokojovou teplotu, nezapomeňte je také důkladně promíchat.

Stručný manuál k nanodropu včetně obrázků některých typů kontaminací naleznete u nanodropu. Případné nedostatky nebo chyby hlaste v laboratoři. Pokud máte pochybnosti, zda měří nanodrop správně, poskytneme vám standard na kontrolu. Při potížích se sekvenací doporučujeme zkontrolovat koncentraci na gelu.

Kvalita a čistota templátu:

DNA musí být zbavena veškerých příměsí, především solí, rozpouštědel, genomové DNA a RNA (ta je v nižší koncentraci tolerována); u PCR fragmentů i zbytků dNTP a primerů. K přečištění doporučujeme používat kolonky nebo u PCR produktů ethanolovou precipitaci (je levnější a má vyšší výtěžky). Ethanolová precipitace je vhodná též k přečištění a zakoncentrování produktů, které po přečištění kolonkami nedávají dobré výsledky. Je zcela nezbytné před rozpuštěním templátu ve vodě důkladně DNA vysušit (např. v otevřené zkumavce zahřát několik minut v cykleru na 60°C).

Pro čištění pomocí kolonek doporučujeme následující podpůrné kroky: nesnažte se zvýšit výtěžek přeloudováním kolonky (vzorek pak může pravděpodobněji obsahovat kontaminanty, které vedou k radikálnímu poklesu až ztrátě signálu) - již v tomto kroku méně znamená více - následné naředění nemusí pomoci a je třeba vzorek znovu přečistit, např. přestrážením.  Po promývání promývacím pufrem, který obsahuje ethanol, kolonku stočte dvakrát (podruhé do vylité zkumavky) tak, aby v ní nezbyly ani stopy po ethanolu. Dále kolonku ještě nechte 5 min odvětrat. Eluci provádějte nejlépe do kvalitní vody, pro sekvenaci je lepší než eluční pufry (přestože ani ty by neměly dělat problémy). Nikdy nepřipravujte DNA do TE pufru, EDTA blokuje sekvenační reakci.

Největším problémem jsou ovšem různé soli, které blokují reakci zcela, nebo jsou příčinou rychlého poklesu signálu. Z tohoto důvodu je někdy kontraproduktivní navyšovat koncentraci DNA v reakci zvýšením množství málo koncentrovaného produktu, protože se tím zároveň zvyšuje i množství kontaminantů.  Řešením v takovém případě je právě přesrážení a rozpuštění ve vodě.

Při neadekvátních výsledcích doporučujeme zvážit, zda na vině není kit nebo nekvalitní voda.

DNA je ve vodě stabilní při pokojové teplotě po dobu několika dnů, vzorky jsou nám zasílány i poštou. Není třeba je nosit na ledu, i když je samozřejmě skladujeme v lednici nebo v mrazáku.

Primery:

Do sekvenační reakce se přidává pouze jeden primer.

Primery by měly být dlouhé optim. 20-25nt (max.18-35nt), G-C content 40-60%, Tm optim. 55-60°C (max. 47-72°C), nesmí tvořit dimery. Přítomnost primer-dimer kontaminace se projeví dvojitou sekvencí do délky asi 130pb. Tento problém můžeme zkusit vyřešit zvýšením teploty nasedání na 60°C. Tento požadavek napište do průvodky. Stejně postupujte při podezření, že primer nasedá na více než jedno místo.

Ujistěte se, že primer je komplementární k vaší DNA. Výjimečně mohou nastat u plasmidů přestavby, inserce nebo delece (nemluvě o záměně vektoru), které znemožní sekvenaci. Při podezření na tento problém je možné vyzkoušet jiný primer, nebo se doporučuje udělat kompletní restrikci plasmidu.

Degenerované primery nebo primery příbuzných organismů (nespecifické), mohou vytvořit pěkný PCR produkt, ale přesto nejsou často použitelné pro sekvenaci . Sekvenační chemie je velice citlivá na přesnost nasedání primeru, zvláště jeho komplementaritu na 3´ konci (záleží především na posledních 8-9 bazích).  Pokud víte, že máte takové primery, uveďte to do speciálních požadavků. Přizpůsobíme profil sekvenační reakce (snižujeme teplotu nasedání) a můžeme dosáhnout lepšího výsledku. Může se také stát, že PCR produkt vznikl pouze za přispění jednoho z primerů (tento pak bude dávat směsný signál, ten druhý nebude mít signál žádný).

Laboratoř dodává některé univerzální primery, naleznete je i s jejich sekvencemi výše. Do naší nabídky jsme nově zařadili i primery delší SP6Long a T7promotorLong, jejichž sekvence by měla umožnit spolehlivější nasedání. Je třeba ovšem zkontrolovat váš plasmid, zda je sekvence skutečně komplementární.

Dalším novým primerem v nabídce je altT7promotor, určený pro sekvenování expresních vektorů řady pET (s výjimkou pET-17, pET-20 a pET-23). Tento primer by měl dávat 2-3x vyšší sílu signálu, sekvenace s klasickým T7promotorem není vždy uspokojivá. Lepší výsledky také dostáváme při sekvenaci z druhé strany primerem T7terminátor.

Výsledky:

Pro kontrolu výsledků vždy doporučujeme prohlédnout také RAW data, na kterých uvidíte celkovou sílu signálu. Pokud je tato nižší než 100 RFU, jedná se o slabší signál. Sekvenátor často celkem dobře přečte i signály kolem 20 RFU. Ovšem je to již na hranici jeho možností. Proto se může stát, že slabý vzorek přečtený z jedné strany, je z druhé strany nečitelný. Na RAW datech také rozlišíte, zda reakce vůbec neproběhla a to, co vidíte na elektroforetogramu, je jen šum, nebo zda reakce proběhla, ale máte směsný signál.

Většinu problémů musíte vyřešit vy lepší přípravou templátu.

Některé typy problémů (opožděná nebo nepravidelná elektroforéza a barevné spiky) řešíme zde a automaticky takové vzorky znovu analyzujeme.

Speciální požadavky:

Při problému s vlásenkou je třeba udělat znovu sekvenační reakci za alternativních podmínek, prodlužujeme denaturační teplotu na začátku reakce a zvyšujeme teplotu nasedání na 60°C. Pokud víte, že vaše sekvence obsahuje HisTag, rovnou požádejte o tento typ sekvenačních podmínek, které zapíšete do speciálních požadavků.

Dalším požadavkem může být bisulfitové sekvenování, používáme speciální protokol pro sekvenační reakci.

Teplotu nasedání můžeme posunou (viz výše), ale protože sekvenační mix nefunguje správně při teplotě vyšší než 60°C, není možné zvýšit teplotu nasedání a elongace nad tuto hodnotu.

Užitečné odkazy:

Užitečné rady pro gelovou extrakci.

http://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-troubleshooting.html

Doporučujeme:

Chcete si prodloužit čtení svých sekvencí? Využijte službu firmy NUCLEICS, která přepočítá vaše .abi soubory svým algoritmem.

http://www.nucleics.com/peaktrace-sequencing/