E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Olympus Cell-R

Rezervace

Pro rezervaci mikroskopu Scan^R použijte Google kalendář.
V popisu rezervace uveďte jméno a linku!
Aktivním uživatelem se lze stát pouze přihlášením do skupiny uživatelů.

Ovládání Mikroskopu

Zapnutí

Při zapínání mikroskopu je vhodné dodržet toto pořadí:

  1. Řídící jednotka mikroskopu Olympus IX2-UCB.
  2. Řídící jednotka kamery Hamamatsu camera controler.
  3. Jednotka MT20 (zapínání vzadu), pokud není ve stand-by stavu.
  4. Řídící jednotka motorizovaného stolku Corvus (zapínání vzadu).
  5. Nakonec zapněte počítač. Ujistěte se, že je zasunut dongle Cell-R. Ovládací software spusťte ikonou "xCellence".

Vypnutí

Při vypínání mikroskopu je důležité zkontrolovat vypnutí fluorescenční lampy přes software. Nic nezkazíte, dodržíte-li obrácené pořadí zapínání. Po vypnutí se ujistěte, že nesvítí kontrolka "Burner On" na jednotce MT20. Svítí-li, vypněte jednotku MT20 síťovým vypínačem vzadu.

Lampu nevypínejte pokud do tří hodin po vás někdo přijde. Pokud skončíte dříve, než jste plánovali, zavolejte na linku dalšího uživatele a ujistěte se zda přijde. Upravte také neprodleně rezervaci v kalendáři, aby případní zájemci viděli, že se uvolnilo místo.

Ovládání vlastního mikroskopu

  • Posun stolku se ovládá pomocí joysticku po pravé straně mikroskopu. Focus wheel Olympus IX80
  • Ostřicí šroub posunuje objektiv směrem ke sklíčku při otáčení v protisměru hodinových ručiček! Mezi módy makrošroub (rychlý posun) a mikrošroub (jemný posun) se přepíná pomocí tlačítka F/C(žlutě). Tlačítko ESC lze použít při výměně preparátů.

  • Čelní panel: Tlačítko vlevo nahoře je na Čelní Panel IX81přepínání mezi cestou světla do objektivu a do kamery. Pod ním dvě tlačítka na rychlý posun objektivu nahoru a dolů. Vpravo od nich tlačítko na rychlé přepnutí na kameru a bleskové vyfocení obrázku. Pod ním Tlačítka na změnu intenzity osvětlení průchozím světlem. Velké čtvercové tlačítko zapíná/vypíná osvětlení průchozím světlem.
  • Dálkové ovládání: Při zapnutém ovládacím softwaru funguje dálkové ovládání. Lze měnit režimy pozorování DIC (Nomarského Diferenciální Kontrast), BF (Brightfield - světlé pole), Tři excitace na třípásmovém emisním filtru DAFITR - DAPI, FITC, TexasRed, Fluorescenční kostky pro GFP (Green Fluorescence Protien), RFP (Red Fluorescence Protein) a CY5 (ozn. fluorescenční barvy). Se změnou objektivu se automaticky změní i odpovídající prisma pro DIC v kondenzoru. Zelené tlačítko ovládá shutter pro fluorescenci.

Dálkové ovládání mikroskopu Olympus IX80

Dálkové ovládání mikroskopu Olympus IX80

Ovládání softwaru

Po zapnutí počítače se ovládací software fy © Olympus Soft Imaging Solutions spustí automaticky v hlavním okně.

Hlavní okno

Na pravém monitoru by se měla zobrazit okna Illumination settings, Camera Control, Microscope a Experiment Manager. Volitelně ještě okno Stage. Okna lze zapnout i vypnout pomocí ikon zvýrazněných červenou linkou v obrázku nahoře.Illumination system

  • Zapněte Fluorescenční lampu v okně Illumintion settings.
  • Chcete-li fotit pomocí Experiment manageru, otevřete si vlastní databázi. Databázi, která se případně otevřela se spuštěním softwaru zavřete (pokud není vaše). Otevření databáze: Menu Database > Open... a ve složce D:\\Archive\ najděte svou složku s databází *.apl. Pokud databázi nemáte, vytvořte si ji příkazem Database > Administration > New Database.... Databázi nazvěte svým jménem a příjmením bez diakritiky a dvakrát potvrďte entrem.
  • MicroscopeCamera controlV tuto chvíli instalujte svůj preparát na mikroskop. Zvolte požadovaný objektiv, přepněte na okulár (okno Microscope nebo tlačítko na čelním panelu), otevřete shutter (okno Illumintion settings) zaostřete a najděte vhodný objekt. Fluorescenční kostky, BF a DIC můžete přepínat v okně Microscope nebo na dálkovém ovladači.
  • Jste-li spokojeni a chcete fotit, zavřete shutter (okno Illumination settings nebo zelené tlačítko na dálkovém ovladači), přepněte na kameru (okno Microscope) a spusťte kameru (tlačítko s kamerou v okně Camera Control). V hlavním okně by se měl objevit obraz z kamery. Pokud ne, stále vidíte například databázi, aktivujte okno s databází kliknutím kdekoliv uvnitř a pomocí klávesové zkratky CTRL+TAB se přepínejte dokud se neobjeví živý obraz z mikroskopu.
  • Nyní nastavte expoziční čas kamery jezdcem v okně Camera control. Správný expoziční čas můžete odhadnout pomocí online histogramu nebo zvýrazněním přesvícených a podsvícených míst (volba "Show saturation" v okně Camera control). Vhodné je, aby se hodnota nejsvětlejších pixelů v histogramu pohybovala mezi 80-ti a 90-ti procenty (červená čára vpravo v okně Online histogram).
  • Online histogramPokud chcete udělat jednu rychlou fotku nejrychlejší je udělat "snapshot" pomocí tlačítka s fotoaparátem v okně Camera control. Výsledný obrázek se nahraje do tzv. Image bufferu, což je sloupec s ikonami obrázků v pravé části hlavního okna. Kliknutím můžete obrázek aktivovat a následně upravit nebo uložit.
  • Chcete-li fotit vícekanálové obrázky, proostření nebo time-laps, použijte Experiment manager. V okně Experiment manageru postavte plán experimentu tak, jak si přejete aby byl preparát nasnímán. Tradiční plán experimentu je vyobrazen na obrázku okna Experiment manageru. Každá položka plánu má své vlastnosti zobrazené v pravé části okna. Je vhodné dát pozor především na nastavený expoziční čas, intenzitu fl. lampy a případně na typ objektivu. Expoziční čas je třeba prozkoumat pro každý kanál zvlášť!
  •  

    Projděte sekvencí "Verify", "Prepare" a "Start" v okně Experiment manageru. Systém zkontroluje experimentální plán z logického hlediska, připraví místo v databázi a zkontroluje připravenost hardwaru a spustí vlastní focení.Experiment Manager

  • Snímky se automaticky ukládají do databáze. Z databáze přetáhněte obrázek do Image bufferu, zpracujte a uložte do složky C:\USER DATA ve formátu TIF. Při ukládání si zkontrolujte nastavení ukládání pod tlačítkem Options v dialogovém okně pro uložení. Zaškrtněnte volbu "Convert 16-bit images to 8-bit" a "Burn overlay into image". Kompresi nastavte na LZW (neztrátová komprese TIFů) a Output format nastavte na Copy of Image Display.
  • Základní zpracování obrázku zahrnuje: úpravu kontrastu (Image > Image Display > Adjust Display...), v případě obrázku s několika optickými rovinami ostrosti deblurring (Process > 3D-Images > 3D Deconvolution) a maximální projekci (Proscess > Projection > Maximu intensity Z). V případě, že používáte filterbloky GFP a Red, je třeba udělat ještě pixel shift (Process > Image geometry > Pixel shift. Stačí vše odentrovat, hodnoty jsou přednastaveny). Možností je přirozeně víc, ale tohle jsou nejčastěji používané úpravy.

Vybavení systému Olympus Cell^R

Systém Olympus Cell^R sestává z invertovaného mikroskopu Olympus IX81 vybaveného motorizovaným stolkem Märzhäuser Wetzlar ovládaného jednotkou Corvus. Jednotka MT20 zajišťuje s pomocí Xenonové výbojky s dlouhou životností stabilní a homogenní excitaci zorného pole. Excitační záření je do mikroskopu vedeno gelový světlovodičem. Doba osvícení preparátu je synchronizována s rychlostí snímání kamery, což šetří životnost fluorescence preparátu. Systém může být v případě potřeby osazen vyhřívaným stolkem a komůrkou s CO2/O2 atmosférou pro pozorování živých buněk v petriho i vícejamkových miskách. Kombinace excitačních a emisních filtrů pokrývá většinu běžně široce používaných fluorescenčních barviv. Oddělení excitačních filtrů od emisních navíc umožňuje v omezené míře kombinovat netradiční excitační a emisní spektra (např. excictace v UV a emise v oblasti CY5).

Objektivy

Objektiv Pracovní vzdálenost Immerze
UPLSAPO 20x Krátká Ne
UPLSAPO 60x Krátká Oil
UPLSAPO 100x Krátká Oil
LUCPLFLN 60x Dlouhá, korekční kroužek Ne
LUCPLFLN 40x Dlouhá, korekční kroužek Ne
LUCPLFLN 20x Dlouhá, korekční kroužek Ne

 Fluorescenční kostky

Filter Set Primary Fluorophores Exciter Center Wavelength Exciter Bandwidth* Emitter Center Wavelength Emitter Bandwidth*
DAFITR Blue band: DAPI, Hoechst, AMCA, BFP, Alexa 350 350 50 457 22
DAFITR Green band: FITC, GFP, rsGFP, Bodipy, Alexa 488 492 18 530 20
DAFITR Red band: Texas Red, MitoTracker Red, Alexa 568 & 594 572 23 628 28
U-MWIBA3 GFP 477,5 17,5 530 20
U-MWIGA3 Red 540 10 600 25
U-N41008 CY5 620 60

700

7

* +/- bandwidth !!!

Kamera

Systém je vybaven vysoce citlivou 12-ti bitovou monochromatickou CCD kamerou Hammatsu ORCA C4742-80-12AG.

Seřízení DIC

Návod na seřízení diferenciálního kontrastu můžete prostudovat v tomto dokumentu.

Akce dokumentů