Vedoucí:

Sandra Huerfano Meneses, Ph.D.

Kontakt:

E-mail: huerfano@natur.cuni.cz
Telefon: 325873916

Kde nás najdete:

Areál BIOCEV ve Vestci u Prahy, 2. patro, křídlo 3 (místnosti 007, 008, 009, 011, 012, 013, 015)
Viničná 5, Praha 2 - Nové Město, přízemí (místnosti 004, 004A, 004B) a 1. patro (místnost 110)

Výzkumná problematika:

Laboratoř virologie se zabývá především studiem malých neobalených DNA virů. Laboratoř vytváří unikátní prostředí spojující základní i aplikovaný virologický výzkum a poskytuje zázemí pro práci bakalářských, magisterských i doktorských studentů. Po mnoho let se výzkum zabývá různými aspekty životního cyklu myšího polyomaviru, modelového viru čeledi Polyomaviridae, která zahrnuje i řadu klinicky významných lidských patogenů, jako jsou viry BKPyV, JCPyV a virus karcinomu Merklových buněk (MCPyV). Studium myšího polyomaviru, který se na rozdíl od lidských polyomavirů snadno kultivuje, tak může analogicky přinést řadu nových poznatků o životním cyklu a buněčné antivirové odpovědi i u lidských zástupců této čeledi. V oblasti aplikovaného výzkumu se laboratoř soustřeďuje na produkci a úpravy umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od polyomavirů. Takovéto částice mohou být po dalších úpravách využity nejen jako účinné vakcíny, ale pravděpodobně i jako nanokontejnery pro dopravu nízkomolekulárních látek, peptidů a exogenních nukleových kyselin do cílových buněk pro terapeutické nebo diagnostické účely. Laboratoř se zabývá i výzkumem vedoucím k přípravě veterinárních vakcín proti prasečím cirkovirům a bovinním papillomavirům.

V současnosti je v Laboratoři virologie řešeno několik projektů. Prvním z nich je studium transportu virových genomů do jádra hostitelské buňky a role minoritních kapsidových proteinů v tomto procesu. Vstup polyomavirů do hostitelských buněk a jejich intracelulární transport je v poslední době velmi intenzivně studován, protože může přinést mnoho zajímavých poznatků o buněčné endocytóze a dopravě extracelulárního materiálu do buněk. Ukazuje se, že viriony se dostávají do endo-lysozomálních kompartmentů a endoplazmatického retikula, kde dochází k jejich částečnému rozvolnění. Mechanizmus, jakým se virus uvolní z těchto kompartmentů a doručí svůj virový genom do jádra, je však nejasný. V tomto procesu mohou hrát zásadní roli minoritní kapsidové proteiny. Pomocí série virových mutant s pozměněnými minoritními proteiny se snažíme odhalit jejich roli v těchto procesech. Pro podchycení kritických událostí spojených s translokací virového genomu do jádra a jeho následné exprese a replikace využíváme elektronovou a konfokální mikroskopii za pomoci inhibitorů a siRNA. Pochopení těchto dějů je totiž nezbytné pro návrh účinných polyomavirových vektorů pro terapeutické a diagnostické účely.

Zabýváme se také vyhledáváním buněčných interakčních partnerů strukturních proteinů polyomavirů v hostitelské buňce. U vytipovaných proteinů dále zkoumáme jejich zapojení v replikačním cyklu viru; hlavně se přitom zaměřujeme na objasnění jejich role v pozdní fázi infekce a při morfogenezi virionu. Charakterizace role buněčných proteinů v těchto dějích by mohla vést k vytvoření cílené antivirové terapie proti polyomavirovým infekcím.

Dalším projektem, který je v současnosti v Laboratoři virologie řešen, je studium možností cílení a dopravy látek do nádorových buněk pomocí VLPs. Umělé polyomavirové částice tvořené pouze kapsidovými proteiny lze efektivně produkovat v heterologních expresních systémech. Modifikací hlavního kapsidového proteinu VP1 je možné u virionů změnit tropizmus viru a stejný přístup lze uplatnit při přesměrovávání VLPs. Různými přístupy (genetické a chemické modifikace) se tedy snažíme změnit povrch a vazebnou specifitu VLPs tak, aby bylo dosaženo „přesměrování“ částic z přirozeného virového receptoru na receptor nádorový. Jako experimentální nádorový model používáme androgen-resistentní buňky lidského nádoru prostaty, které exprimují na svém povrchu prostatický membránový antigen (PSMA). Součástí projektu je i vývoj technologie in vitro enkapsidace nízkomolekulárních látek (např. kontrastních látek pro MRI diagnostiku) a terapeutických nukleových kyselin do takto modifikovaných částic. Zároveň jsou částice upravovány tak, aby docházelo k efektivnímu uvolnění jejich obsahu uvnitř cílové buňky. Z hlediska nanotechnologií mají VLPs několik unikátních bio-chemických vlastností (jsou biodegradovatelné a na rozdíl od ostatních polymerů mají dobře definovaný tvar a strukturu) a lze je tedy využít jako lešení pro konstrukci nanoobjektů využitelných v biomedicíně. Ve spolupráci se skupinou Syntetické nanochemie Petra Cíglera (ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha) využíváme polyomavirové VLPs jako templáty pro výrobu nanoplasmonických materiálů. Na všech projektech spolupracujeme s biochemickou laboratoří ÚOCHB, vedenou Dr. Janem Konvalinkou, a skupinou Koordinační a bioanorganické chemie na katedře anorganické chemie PřF UK v Praze (doc. Jan Kotek).

Třetím důležitým projektem, kterému se Laboratoř virologie věnuje a který zasahuje do aplikovaného výzkumu,  je příprava rekombinantních vakcín proti prasečímu cirkoviru 2 (PCV2) založených na strukturních proteinech myšího polyomavirus a příprava vakcín proti bovinním papillomavirům (ve spolupráci s firmou Dyntec, s.r.o.). PCV2 je malý neobalený virus s genomem tvořeným jednořetězcovou DNA, který způsobuje závažné onemocnění prasat – PCVAD (porcine circoviral associated disease). Hlavní antigenní determinantou PCV2 je protein Cap, který tvoří virovou kapsidu. Vzhledem k tomu, že kultivace PCV2 a heterologní produkce Cap proteinu ve formě VLPs je velmi obtížná, využíváme při produkci vakcinačních antigenů kapsidové struktury myšího polyomaviru jako nosiče pro Cap protein nebo jeho epitopy. Připravili jsme řadu konstruktů s vybranými imunogenními Cap epitopy umístěnými na povrchu nebo uvnitř VLPs odovozených od myšího polyomaviru, případně jako fúzní proteiny mezi Cap proteinem a hlavním kapsidovým proteinem myšího polyomaviru VP1. Fúze obou proteinů sice nedovolí, aby se formovaly plnohodnotné VLPs, ale uspořádání do virových kapsomer není narušeno. Ukazuje se, že všechny tyto přístupy vedou k indukci specifické imunitní odpovědi proti Cap proteinu a mohou být východiskem pro přípravu účinné a komerčně zajímavé vakcíny proti PCV2.

Laboratoř se podílí i na přípravě vakcíny proti bovinním papillomavirům. Bovinní papilomaviry (BVP) vyvolávají u skotu kožní a slizniční léze a nádory močového měchýře. Onemocnění může mít u dojících krav a sajících telat závažné ekonomické dopady, neboť krávy s papilomy na strucích vemen nemohou být dojeny (infekce může být doprovázena i záněty mléčné žlázy) a infikovaná telata s lézemi v dutině ústní nemohou sát. Navíc jsou tyto viry přenosné na koně. Dosud jsou dostupné pouze inaktivované vakcíny připravené z orgánových extraktů postižených zvířat. My pro přípravu preventivní vakcíny využíváme bakulovirový expresní systém, pomocí kterého produkujeme VLPs tvořené papillomavirovými proteiny L1 a L2.

Konečně posledním zajímavým projektem Laboratoře je vývoj nových diagnostických prostředků pro detekci druhově specifických protilátek proti BKPyV a MCPyV (ve spolupráci s firmou VIDIA s.r.o.). Lidské polyomaviry BKPyV a MCPyV latentně infikují většinu lidí. U imunodeficientních pacientů však mohou způsobovat těžké nemoci se závažným dopadem na průběh léčby. MCPyV je původcem karcinomu Merkelových buněk a BKPyV vyvolává u příjemců transplantátu ledvin nefropatii, provázenou rizikem akutního odloučení transplantátu, a u příjemců transplantátu krvetvorných buněk hemorrhagickou cystitidu. U infikovaných lidí se protilátky tvoří hlavně proti kapsidovému proteinu VP1. U BKPyV lze na základě polymorfizmů ve VP1 proteinu, v oblasti vážící receptor, rozlišit 4 subtypy BKPyV. Ukázalo se, že osoby s vysokou hladinou protilátek proti subtypu BKPyV-I nejsou schopny neutralizovat infekci BKPyV-IV, což může mít při transplantacích, kdy se neshoduje BKPyV subtyp mezi příjemcem a dárcem, závažné důsledky. Druhově specifické antigeny, založené na rekombinantním VP1, byly dosud připraveny jen experimentálně a použity pro limitované sérologické studie. Ve spolupráci s firmou VIDIA spol. s r.o. proto vyvíjíme diagnostický multiplexový konfirmační LIA (immuno-line) test založený na technologii rekombinantních VLPs na souběžné stanovení protilátek proti BKPyV (včetně subtypově specifických), MCPyV a polyomaviru JC, pro klinické použití.

Ve spolupráci se skupinou Jitky Forstové studuje skupina Ivana Hirsche v rámci Laboratoře virologie roli přirozené imunity při eliminaci genomu viru Hepatitidy B z jader infikovaných buněk. Tato skupina se rovněž dlouhodobě zabývá možností eradikace rezervoáru HIV rezistentního na léčbu kombinovanou terapií.

Členové Laboratoře jsou zároveň členy výzkumného týmu "Interakce virových a buněčných struktur v průběhu virové infekce a vývoj nanostruktur pro medicínské a veterinární účely" působícího v rámci programu "Buněčná biologie a virologie" v biotechnologickém a biomedicínském centru AV ČR a UK v Praze BIOCEV .