E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Laboratoř imunoterapie

Vedoucí:

RNDr. Michal Šmahel, Ph.D.

Kontakt:

E-mail: smahelm@natur.cuni.cz
Telefon: 325 873 921, 325 873 947, 325 873 941

Kde nás najdete:

Areál BIOCEV ve Vestci u Prahy, 2. patro, křídlo 3 (místnosti 017, 004, 007)

Členové Laboratoře

        Metodické a technické zázemí

Publikace

        Vědecko-výzkumné spolupráce

Nabízená témata VŠ kvalifikačních prací pro nové studenty

Výzkumná problematika:

Laboratoř imunoterapie byla založena v roce 2015 skupinou pracovníků, kteří přestoupili z Ústavu hematologie a krevní transfuze a zapojili se jako výzkumný tým "Imunizace proti nádorům vyvolaným lidskými viry" do programu Buněčná biologie a virologie v nově vzniklém výzkumném centru BIOCEV ve Vestci u Prahy.  Činnost laboratoře je zaměřena na imunoterapii nádorů vyvolaných viry, která je experimentálně testována na myších modelech nádorů, na jejichž vzniku se podílejí lidské papillomaviry.

Laboratoř se zabývá zejména vývojem protinádorových DNA vakcín podávaných biolisticky genovou pistolí. Imunizace je namířena nejen proti vlastním nádorovým buňkám, ale také proti buňkám nádorového stromatu, které mohou podporovat růst nádorů, zejména proti makrofágům. Pozornost je věnována i antigenům nádorových kmenových buněk, které bývají odolné k různým postupům terapie nádorů a jsou tak hlavní příčinou relapsu onemocnění a vývoje metastáz.

Účinnost DNA vakcín je možné zvýšit různými modifikacemi imunizačních genů, jejichž výsledkem je vznik fúzních (chimerických) genů. První princip, který při konstrukci fúzních genů využíváme, je změna buněčné lokalizace proteinů, která má nasměrovat imunogen do dráhy prezentace epitopů pomocí molekul MHC 1. nebo 2. třídy. Toho dosahujeme pomocí lokalizačních sekvencí lysozomálního proteinu LAMP-1, které zajišťují nejprve transport fúzních proteinů do endoplazmatického retikula a následně do endozomů a lysozomů. Dále zvyšujeme imunogennost DNA vakcín připojením pomocného epitopu aktivujícího pomocné CD4+ lymfocyty T (Th). Pro tento účel jsme využili jednak univerzální epitop z tetanového toxinu (TT) p30 (TT947-967) a  nověji pak používáme in silico navržený epitop PADRE, který je v našem modelovém systému účinnější. Protože cílem naší DNA vakcinace jsou často proteiny s onkogenním potenciálem, snižujeme transformační vlastnosti těchto imunogenů cílenou mutagenezí, která zvyšuje bezpečnost DNA vakcín.

Pokud nejsou u antigenů, proti kterým vyvoláváme imunitní reakce, známy H-2b epitopy, provádíme počítačovou predikci těchto epitopů. Reaktivitu potenciálních epitopů pak ověřujeme ve formě syntetických peptidů testem ELISPOT. Nalezené epitopy nám umožňují testování imunitních reakcí in vitro a přispívají tak k optimalizaci imunoterapeutických postupů.

Zatímco u cizorodých antigenů, kterými jsou například papillomavirové onkoproteiny E6 a E7, je DNA vakcinace schopna redukovat růst nádorů, imunizace proti proteinům, které představují antigeny tělu vlastní, sice může vyvolat imunitní reakce, ale protinádorový efekt bývá nízký. Snažíme se proto o posílení účinku DNA vakcinace inhibicí imunosupresivních mechanismů, které napomáhají růstu nádorů. Jedním z možných přístupů, který využíváme, je odstranění regulačních lymfocytů T (Treg) pomocí protilátky proti receptoru pro interleukin 2 (IL-2), molekule CD25. Dále kombinujeme DNA vakcinaci s podáváním protilátek, které blokují inhibiční receptory CTLA-4 a PD-1. Tyto receptory se vyskytují na různých subpopulacích T buněk a regulují jejich činnost v různých fázích aktivace. Jejich zablokování brání přirozenému utlumení imunitních reakcí indukovaných například vakcinací nebo částečnou eliminací nádorových buněk jinými způsoby terapie nádorů. Protilátky proti CTLA-4 a PD-1 se již osvědčily v klinických studiích a začaly být používány v běžné klinické praxi.

Hlavní protinádorový účinek protilátek blokujících receptory CTLA-4 a PD-1 spočívá ve zvýšení činnosti cytotoxických lymfocytů T rozpoznávajících nádorové buňky, které na svém povrchu prezentují  epitopy navázané na molekuly MHC 1. třídy (MHC-I). Nádorům se však často daří vyhnout se zásahu těchto imunitních buněk díky genetické nestabilitě nádorových buněk a selekci jejich variant se sníženou expresí molekul MHC-I. Při vývoji myšího modelu jsme se proto zaměřili na odvození onkogenních buněčných klonů s redukovaným množstvím MHC-I. Tato redukce může být buď reverzibilní, nebo ireverzibilní. Při reverzibilní změně, která je způsobena epigenetickými regulacemi, je možné povrchovou expresi molekul MHC-I obnovit indukcí např. interferonem γ (IFN-γ). Ireverzibilní změny jsou podmíněny genetickými mutacemi, které mohou mít různé fenotypové projevy. K úplné ztrátě povrchové exprese MHC-I dochází například při poruše produkce β2-mikroglobulinu. Nádorové klony s reverzibilně sníženou expresí molekul MHC-I se nám v minulosti podařilo získat z nádorů myší, ve kterých byly tyto klony přirozeně selektovány po DNA imunizaci proti onkoproteinu E7. Nově nyní připravujeme klony, ve kterých je s použitím systému CRISPR-Cas9 inaktivován gen pro β2-mikroglobulin a je tak dosaženo ireverzibilní ztráty povrchové exprese MHC-I.

Nádorové buňky se sníženou expresí molekul MHC-I jsou sice necitlivé k působení cytotoxických lymfocytů T, zvyšuje se však u nich většinou citlivost k zásahu NK buňkami a mohou být zničeny i dalšími buňkami přirozené imunity, např. makrofágy. Zabýváme se proto vývojem kombinovaných imunoterapeutických postupů, které by aktivovaly různé buňky adaptivní a vrozené imunity a byly tak účinné proti nádorovým buňkám s rozdílnou mírou exprese molekul MHC-I. Kromě postupů uvedených výše využíváme také aktivaci imunitních buněk agonisty toll-like receptorů (TLR) a budeme používat blokování inhibičního receptoru Tim-3, který je exprimován na aktivovaných lymfocytech T, ale také na makrofázích a dendritických buňkách. Jedním z cílů kombinované imunoterapie by měla být přeměna pronádorových makrofágů typu M2 na protinádorové makrofágy typu M1, které by mohly být účinné při inhibici růstu nádorů vyvolaných buňkami s redukcí molekul MHC-I.

Mikroprostředí nádoru je složitým komplexem různých typů buněk, které se rozličnými mechanismy podílejí na vývoji nádorů nebo naopak přispívají k protinádorovým reakcím. Jedním z našich cílů je i charakterizace těchto mechanismů a sledování jejich ovlivnění imunoterapeutickými postupy. Provádíme proto izolaci buněk z nádorů a jejich fenotypizaci a dále z nádorů izolujeme RNA a stanovujeme expresi vybraných genů, jejichž produkty ovlivňují imunitní reakce.

Akce dokumentů