E-mail | SIS | Moodle | Helpdesk | Knihovny | cuni.cz | CIS Více

česky | english Přihlášení



Seminář: Mgr. Karel Doležal, DSc. a Mgr. Jan Holub

Mgr. Karel Doležal, DSc. a Mgr. Jan Holub - Pokroky v syntéze a analýze cytokininů
Čas 14.11.2017
od 15:00 do 16:30
Přiložený soubor: 2017_ZS_seminar_07_Dolezal.pdf
Přidat událost do kalendáře Google
vKalendář (Windows, Linux)
iCal (Mac OS X)

Pokroky v syntéze a analýze cytokininů

 

Mgr. Karel Doležal, DSc. 

(Laboratoři růstových regulátorů PřF UP & UEB AV ČR Olomouc a Oddělení chemické biologie a genetiky Centra regionu Haná pro zemědělský a biotechnologický výzkum)

Mgr. Jan Holub

Jan Holub s.r.o.

 

Cytokininy jsou významnou skupinou rostlinných hormonů, látek zásadně regulujících růst a vývoj rostlin. Bylo zjištěno, že i malá změna v chemické struktuře těchto N6-substituovaných derivátů adeninu může vézt k dramatickým změnám v jejich biologické aktivitě. Mezi námi připravenými cytokininovými deriváty tak byly objeveny první reálné anti-cytokininy či velmi účinné inhibitory cytokininové degradace. Bylo také prokázáno, že tyto látky, či jejich příbuzné syntetické deriváty, mají schopnost unikátním mechanizmem ovlivňovat nejen rostlinné buňky, ale také růst a vývoj lidských nádorových buněk či kožních fibroblastů a tedy potenciál širokého spektra aplikací nejen v zemědělství a rostlinných biotechnologiích, ale také v medicíně či kosmetologii.

Analýza endogenních cytokininů v rostlinném materiálu je problematická zejména z důvodu jejich extrémně nízkých endogenních koncentrací (u mnoha metabolitů zpravidla pod 1 pmol na gram čerstvé hmoty) a složitosti rostlinné matrice. Rychlý technologický vývoj v posledních letech se nevyhnul ani hmotnostní spektrometrii a přinesl zásadní změny i do analýzy rostlinných hormonů; poprvé umožnil například kvantifikaci cytokininů v miligramových množstvích pletiva. Na našem pracovišti jsme vyvinuli novou UPLC-ESI(+)MS/MS metodu pro rychlé a extrémně citlivé stanovení cytokininů v rostlinných extraktech. Tato metoda využívá spojení ultra-účinné kapalinové chromatografie s trojitým quadrupolem  vybaveným ionizací elektrosprejem.  Zcela nedávno jsme také prezentovali pravděpodobně první metody pro přímou identifikaci kvantifikaci cytokininových nukleotidů (mono-, di- a trifosfáty, první cytokininy biosyntetické dráhy).

Avšak pro stanovení endogenních cytokininů vyskytujících se ve femtomolárních koncentracích v relativně velmi komplexních extraktech je třeba také účinných separačních a purifikačních technik. Proto je v poslední době našim hlavním cílem další miniaturizace naší současné metody izolace cytokininů tak, aby postup byl použitelný pro vzorky o velikosti 1-5 mg rostlinného materiálu a menší. Pro tento účel jsme výrazně modifikovali jak extrakci na pevné fázi (SPE), tak následnou imunoafinitní chromatografii (IAC). SPE je nově prováděna na mikrokolonách sestavených v pipetovací špičce, StageTip (STop And Go Extraction Tip), a kombinována se vsádkovou imunopurifikací za použití skupinově-specifických monoklonálních protilátek imobilizovaných na chitosanem pokrytých nanočásticích magnetitu.V tomto uspořádání se jedná o rychlou, relativně levnou, jednoduchou, zároveň ale robustní izolační mikrometodu s vysokou propustností, která v kombinaci s vylepšenou rychlou chromatografickou separací a citlivou a selektivní hmotnostně spektrometrickou detekcí poskytuje velmi účinný nástroj pro analýzu cytokininů ve velmi malém množství rostlinného materiálů. S využitím těchto metod bylo možné kvantifikaci cytokininů posunout na buněčnou resp. subcelulární úroveň, což bylo ještě před několika lety nepředstavitelné.

Dostupnost moderních analytických technik nám také umožnila kvantifikaci metabolických produktů cytokininů, exogenně aplikovaných do rostlinných tkáňových kultur. Nedostatečné zakořeňování či špatná aklimatizace explantátů, množených in vitro na médiu s přídavkem 6-benzylaminopurinu, mohly tak být překonány aplikací nových cytokininových derivátů, vykazujících  nižší endogenní akumulací produktů jejich ireverzibilní degradace.

Součástí prezentace bude také představení strategie a  technologií, využívaných při  in vitro mikropropagaci a následné ex vitro  aklimatizaci vybraných druhů a odrůd drobného ovoce ve firmě Jan Holub s.r.o.

Pozvánka ke stažení ZDE.

Publikováno: Úterý 07.11.2017 00:00

Akce dokumentů